Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.
Ons doel is het verkrijgen van een uitgebreide beschrijving van moleculaire processen die zich op cellulaire membranen in verschillende biologische functies. Wij richten ons op het karakteriseren van de complexe organisatie en de dynamiek van het plasmamembraan bij single-molecule-niveau, door het ontwikkelen van analytische tools gewijd aan Single-Particle Tracking (SPT) bij hoge dichtheid: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Single-molecule videomicroscopy, het aanbieden van milliseconde en nanometrische resolutie 1-11, laat een gedetailleerde weergave van membraan organisatie 12-14 door nauwkeurig in kaart brengen van omschrijvingen zoals mobiele receptoren lokalisatie, mobiliteit, opsluiting of interacties.
We herzien SPT, zowel experimenteel als algoritmisch. Experimentele aspecten omvatte het optimaliseren van installatie-en cel etikettering, met een bijzondere nadruk op het bereiken van de hoogst mogelijke etikettering dichtheid, met het oog op een dynamische momentopname van moleculaire dynamica a. het verstrekken vans het plaatsvindt binnen het membraan. Algoritmische problemen betrokken elke stap wordt gebruikt voor de wederopbouw van trajecten: pieken detectie, schatting en opnieuw verbinden, aangepakt door specifieke tools van beeldanalyse 15,16. Uitvoering van deflatie na detectie kan redden van pieken in eerste instantie verborgen door naburige, sterkere pieken. Van de nota, het verbeteren van detectie direct invloed op heraansluiting, door vermindering van de lacunes binnen de trajecten. Optredens zijn onderzocht met behulp van Monte-Carlo simulaties voor verschillende etikettering dichtheid en geruisloosheid, die doorgaans de twee belangrijkste beperkingen voor parallelle metingen bij hoge spatio-temporele resolutie.
De nanometrische nauwkeurigheid 17 verkregen voor enkele moleculen, met behulp van opeenvolgende aan / uit photoswitching of niet-lineaire optica, kan leveren uitputtend waarnemingen. Dit is de basis van nanoscopy methoden 17 zoals STORM 18, PALM 19,20, RESOLFT 21 of STED 22,23, whilel kan vaak beeldvorming gefixeerde monsters. De centrale taak is het opsporen en de schatting van diffractie-beperkte pieken afkomstig van enkele moleculen. Vandaar dat het verstrekken van adequate veronderstellingen, zoals het hanteren van een constante positionele nauwkeurigheid in plaats van de Brownse beweging, wordt MTT ronduit geschikt voor nanoscopische analyses. Bovendien kan MTT fundamenteel worden gebruikt op elke schaal: niet alleen moleculen, maar ook voor cellen of dieren, bijvoorbeeld. Vandaar dat MTT is een krachtige tracking algorithme, dat toepassing vindt op moleculair en cellulair schalen.
In enkele deeltjes volgen, naast de cel en microscopie aspecten de analyse een aanzienlijk deel van het werk. Dit heeft betrekking op het algoritme gebruikt om de drie belangrijkste taken uit te voeren: het opsporen, schatten en opnieuw aansluiten van toppen boven elk frame. Maar de daaruit voortvloeiende aspect van dit werk ligt in de uitwerking van het algoritme zelf, die dienen te worden aangepast voor een nieuw speciaal onderzoek, hoofdzakelijk voor de laatste, extra stappen (zoals het ontcijferen van vormen van bew…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de leden van ons team, met name MC Blache voor technische bijstand, maar ook M Irla en B Imhof, voor hun steun en vruchtbare discussies. De cijfers voor deflatie en opsluiting gereproduceerd met toestemming van Nature Methods. Dit project wordt ondersteund door institutionele subsidies van de CNRS, INSERM en Marseille University, en door specifieke subsidies van de regio Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 Blan 1214 01) & Fondation pour la Recherche Medicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR wordt ondersteund door een beurs van de Ligue Nationale Contre le Cancer.
Reagent | Company | Catalogue number | Quantity |
Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
HBSS without Ca2+ | GIBCO | 14175 | 1 ml |
0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 | 1 ml |
8-well Lab-tek | NUNC | 155441 | 1 |
QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21435 | 18.5 μg |
Complete medium | |||
DMEM | GIBCO | 41965 | 500 ml |
Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | 50 ml |
L-Glutamine | GIBCO | 25030 | 5 ml |
HEPES | GIBCO | 15630 | 5 ml |
Sodium Pyruvate | GIBCO | 11360 | 5 ml |
Imaging medium | |||
HBSS with Ca2+ | GIBCO | 14025 | 25 ml |
HEPES | GIBCO | 15630 | 250 μl |
Equipment | Company | Reference |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000U |
Fluorescent lamp | Nikon | Intensilight C-HGFIE |
1.3 NA 100x objective | Nikon | Plan Fluor 1.30 |
1.49 NA 100x objective | Nikon | APO TIRF 1.49 |
Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B |
Thermostated box | Life Imaging Services | The Box |
Appendix: example Script of MTT supplementary analysis
function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities
if nargin<1 % no file_name provided?
files = dir(‘*.stk’);
if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
file_name = files(1).name; % default: first stk file
disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end
file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file
%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3
% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …
% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);
tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);
%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums
for itrc = 1:N_traces
No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end
%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)