Kortlægning af molekylær diffusion i plasmamembranen ved Multiple-Target Tracing (MTT)

Summary

Multipel-Target Sporingen er en hjemmelavet algoritme udviklet til sporing individuelt mærkede molekyler i plasmamembranen af ​​levende celler. Effektiv opdage, vurdere og sporing molekyler over tid ved høj densitet giver et brugervenligt, omfattende værktøj til at undersøge nanoskala membran dynamik.

Abstract

Vores mål er at opnå en omfattende beskrivelse af molekylære processer finder sted på cellemembraner i forskellige biologiske funktioner. Vi stræber efter at karakterisere den komplekse organisation og dynamikken i plasmamembranen på enkelt-molekyle niveau, ved at udvikle analytiske værktøjer dedikeret til enkelt-partikel Tracking (SPT) ved høj tæthed: Multiple-Target Tracing (MTT) ^1. Enkelt molekyle videomicroscopy, giver millisekund og nanometrisk opløsning ^1-11, tillader en detaljeret afbildning af membranen organisation ^12-14 ved nøjagtig kortlægning deskriptorer såsom celle-receptorer lokalisering, mobilitet, indespærring eller interaktioner.

Vi fornyet SPT, både eksperimentelt og algoritmer. Eksperimentelle aspekter omfattede optimering opsætning og celle mærkning, med særlig vægt på at nå den højest mulige mærkning tæthed, for at skabe en dynamisk øjebliksbillede af molekylær dynamik ens det forekommer inde i membranen. Algoritmiske problemer pågældende hvert trin anvendes til at genopbygge baner: toppe detektion, estimering og gentilslutning, behandles af specifikke værktøjer fra billedanalyse ^15,16. Implementering deflation efter afsløring giver redde toppe i første omgang skjult af tilstødende, stærkere toppe. Det skal bemærkes, direkte forbedre afsløring påvirker gentilslutning, ved at reducere huller i baner. Forestillinger er blevet evalueret ved brug Monte-Carlo simuleringer for forskellige mærkning tæthed og støj værdier, som typisk udgør de to store begrænsninger for parallelle målinger med høj spatiotemporal opløsning.

Den nanometrisk nøjagtighed ¹⁷ opnået for enkelte molekyler, enten ved hjælp af successive on / off photoswitching eller ikke-lineær optik, kan levere udtømmende observationer. Dette er grundlaget for Nanoscopy metoder ^17, såsom STORM ^18, PALM ^19,20, RESOLFT ²¹ eller place ^22,23, whiCH kan kræver ofte billeddannende faste prøver. Den centrale opgave er at afsløre og vurdering af diffraktion-begrænsede toppe stammer fra enkelt-molekyler. Derfor giver tilstrækkelige forudsætninger, såsom håndtering af et konstant positionsnøjagtighed i stedet for Brownsk bevægelse, er MTT ligefrem velegnet til nanoskopiske analyser. Endvidere kan MTT fundamentalt anvendes i enhver skala: ikke blot molekyler, men også for celler eller dyr, f.eks. Derfor MTT er en effektiv sporing algoritme, der finder anvendelse på molekylære og cellulære skalaer.

Protocol

I denne video, præsenterer vi en helt enkelt partikel sporing eksperiment, ved hjælp af kvante-prikker målrettet til en specifik membran receptor. Hovedmålet med dette eksperiment består i kræsne forskellige typer molekylær diffusion adfærd målt i plasmamembranen af ​​levende celler. Faktisk kan molekylære bevægelser, der opstår på membranen typisk afvige fra Brownsk diffusion ved at blive lineært rettet eller begrænset i nanodomains 26-29, f.eks. Vi stræber efter at samtidig efter så man…

Discussion

I enkelt-partikel tracking,, ved siden af ​​de celle og mikroskopi aspekter analysen udgør en væsentlig del af arbejdet. Dette omhandler algoritme, der anvendes til at udføre de tre hovedopgaver: afsløre, estimering og tilslutte toppe over hver frame. Men den deraf følgende aspekter af dette arbejde ligger i udarbejdelsen af ​​algoritmen selv, som måske skal tilpasses til en ny dedikeret undersøgelse, hovedsagelig i de sidste og ekstra skridt (såsom at dechifrere former for bevægelse, interaktion eller …

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Quantity
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-well Lab-tek	NUNC	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Scientific	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 μl

 

Equipment	Company	Reference
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box

Appendix: example Script of MTT supplementary analysis

function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities

if nargin<1 % no file_name provided?
    files = dir(‘*.stk’);
    if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
    file_name = files(1).name; % default: first stk file
    disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end

file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file

%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3

% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …

% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);

tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);

%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums

for itrc = 1:N_traces
    No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
     plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
    xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
    title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
    disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)