Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays
Summary
Laten we zien hoe te ontleden en cultuur chick E4 statoacoustic ganglion en E6 ruggenmerg explantaten. Explantaten worden gekweekt onder serum-vrije omstandigheden in 3D collageen gels voor 24 uur. Neurieten responsiviteit is getest met de groei factor-aangevuld medium en met eiwit-gecoate kralen.
Abstract
De zintuigen van de kip binnenoor worden geïnnerveerd door de perifere processen van statoacoustic ganglion (SAG) neuronen. Zintuig innervatie is afhankelijk van een combinatie van een axon begeleiding signalen 1 en 2 survival factoren gelegen langs het traject van de groeiende axonen en / of binnen hun zintuig doelen. Bijvoorbeeld, functionele interferentie met een klassieke axon begeleiding signaalweg, semaphorin-neuropilin, gegenereerd misrouting van otic axonen 3. Ook verschillende groeifactoren, uitgedrukt in de sensorische doelstellingen van het binnenoor, waaronder neurotrofine-3 (NT-3) en Brain afgeleide neurotrofe factor (BDNF), zijn gemanipuleerd in transgene dieren, weer wat leidt tot misrouting van SAG axonen 4. Deze zelfde moleculen bevorderen, zowel overleving en uitgroei van neurieten van kuiken SAG neuronen in vitro 5,6.
We beschrijven hier en demonstreren van de in-vitro-methode die wij op dit moment are uzingen voor de responsiviteit van kuiken SAG neurieten test om oplosbare eiwitten, waaronder bekende morphogens zoals de Wnts, evenals de groei factoren die van belang zijn voor het bevorderen van SAG neurietuitgroei en neuron overleven. Met behulp van dit model systeem, hopen we conclusies over de effecten die uitgescheiden liganden kunnen uitoefenen op de SAG neuron overleving en neurietuitgroei trekken.
SAG explantaten worden ontleed op embryonale dag 4 (E4) en gekweekt in drie-dimensionale collageen gels onder serum-vrije omstandigheden gedurende 24 uur. Ten eerste is neurieten reactievermogen getest door het kweken van explantaten met eiwit-aangevuld medium. Dan, om te vragen of puntbronnen van uitgescheiden liganden kunnen directionele effecten op neurietuitgroei hebben, zijn explantaten samen gekweekt met eiwit-gecoate kralen en getest op het vermogen van de kraal om lokaal bevorderen of belemmeren uitgroei. We hebben ook een demonstratie van de dissectie (gewijzigde protocol 7) en de cultuur van E6 ruggenmerg explantaten. Wijroutinematig gebruik van het ruggenmerg explantaten op bioactiviteit van de eiwitten en eiwit-doordrenkte kralen te bevestigen en te controleren soort cross-reactiviteit met chick weefsel, onder dezelfde voorwaarden als de cultuur SAG explantaten. Deze in vitro testen zijn handig voor het snel screenen op moleculen die trofische (overleving) of tropische (directionele) effecten op de SAG neuronen uit te oefenen, vooral vóór het uitvoeren van studies in vivo. Bovendien is deze methode maakt het testen van individuele moleculen onder serum-vrije omstandigheden, met een hoge neuron overleven 8.
Protocol
Discussion
Wij presenteren een methode te ontleden en cultuur E4 SAG en E6 ruggenmerg explantaten, van kuiken, onder serum-vrije omstandigheden. Deze procedure wordt momenteel gebruikt in ons lab aan de gevolgen van de verschillende afgescheiden liganden op SAG neuron overleving en neurietuitgroei studie. Nieuwe aspecten van dit protocol zijn het gebruik van een serum-vrij systeem voor het kweken van explantaten en het gebruik van kralen gedrenkt in groeifactoren de effecten op de SAG neurietuitgroei te bestuderen. Een kraal metho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health Grant RO1DC002756 en de Purdue Research Foundation. Wij danken Doris Wu en Wiese Chang voor advies met experimenten en Rodney McPhail voor hulp met cijfers.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
|
||
| Dissection microscope |
|
We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
|
||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
|
||
|
|||
| Dissection Materials |
|
||
| Sylgard© coated petri dish |
|
||
| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
|
|||
| E4 and E6 chicken eggs |
|
||
| Chick Ringer’s solution |
|
Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
|
|||
| Collagen preparation |
|
||
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
|
|||
| Explant culture |
|
||
| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
|
|||
| Immunohistochemistry |
|
||
| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
|
Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
References
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
