Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites
Summary
Nous démontrons comment disséquer et à la culture chiches E4 et E6 ganglionnaires statoacoustic explants de la moelle épinière. Les explants sont cultivés dans un milieu sans sérum dans des gels de collagène 3D pour 24 heures. Réactivité neurites est testé avec support du facteur de croissance complété et revêtu de protéine avec des perles.
Abstract
Les organes sensoriels de l'oreille interne de poulet sont innervés par le processus périphériques du ganglion statoacoustic (SAG) des neurones. Innervation organe sensoriel repose sur une combinaison de signaux de guidage axonal 1 et 2 facteurs de survie situé le long de la trajectoire des axones en croissance et / ou au sein de leurs objectifs organe sensoriel. Par exemple, les interférences fonctionnelles avec une voie de guidage des axones classiques de signalisation, sémaphorine-neuropiline, a généré l'erreur d'acheminement des axones otique 3. En outre, plusieurs facteurs de croissance exprimés dans les objectifs sensorielles de l'oreille interne, y compris la neurotrophine-3 (NT-3) et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), ont été manipulées dans des animaux transgéniques, conduisant de nouveau à l'erreur d'acheminement de 4 axones SAG. Ces mêmes molécules promouvoir à la fois la survie et la croissance des neurites de neurones in vitro de la SAG chiches 5,6.
Ici, nous décrire et démontrer la méthode in vitro nous sommes actuellement uchantent pour tester la réactivité des neurites SAG chiches aux protéines solubles, y compris morphogènes connus tels que les Wnts, ainsi que les facteurs de croissance qui sont importants pour la promotion de la croissance des neurites SAG et la survie des neurones. L'utilisation de ce système modèle, nous espérons pouvoir tirer des conclusions sur les effets que les ligands sécrétés peuvent exercer sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites.
Explants SAG sont disséqués au jour embryonnaire 4 (E4) et cultivées dans des gels de collagène en trois dimensions dans un milieu sans sérum pendant 24 heures. Tout d'abord, la réactivité des neurites est testé par des explants de culture avec des protéines complétés moyenne. Puis, de se demander si les sources ponctuelles de ligands sécrétés peuvent avoir des effets directionnels sur l'excroissance des neurites, les explants sont co-cultivées avec des billes recouvertes de protéines et analysés pour la capacité de la perle localement promouvoir ou inhiber le développement. Nous incluons également une démonstration de la dissection (modifié le protocole 7) et la culture des explants E6 moelle épinière. Nousutilisent couramment des explants de moelle épinière pour confirmer la bioactivité des protéines et protéines-trempés perles, et de vérifier les espèces réactivité croisée avec des tissus de poussins, dans les conditions même culture que les explants SAG. Ces tests in vitro sont pratique pour rapidement criblage de molécules qui exercent trophiques (survie) ou Tropic (directionnelle) effets sur les neurones du SAG, surtout avant d'effectuer des études in vivo. Par ailleurs, cette méthode permet de tester des molécules individuelles dans un milieu sans sérum, avec des neurones de survie élevé 8.
Protocol
Discussion
Nous présentons une méthode de disséquer et de la culture E4 SAG et E6 explants de la moelle épinière, de poussins, sous des conditions sans sérum. Cette procédure est actuellement utilisée dans notre laboratoire pour étudier les effets des différents ligands sécrétés sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites. De nouveaux aspects de ce protocole comprennent l'utilisation d'un système sans sérum pour les explants en culture et l'utilisation de billes trempées dans les facteu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé et de la Subvention RO1DC002756 Purdue Research Foundation. Nous tenons à remercier Doris Chang Wu et Wiese pour des conseils avec des expériences et McPhail Rodney à l'aide de chiffres.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
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| Dissection microscope |
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We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
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| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
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| Dissection Materials |
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| Sylgard© coated petri dish |
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| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
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| E4 and E6 chicken eggs |
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| Chick Ringer’s solution |
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Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
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| Collagen preparation |
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| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
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| Explant culture |
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| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
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| Immunohistochemistry |
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| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
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Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
References
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
