Dissezione e Cultura della gangliari Chick Statoacoustic Espianti e del midollo spinale in gel di collagene per saggi crescita dei neuriti
Summary
Dimostriamo come sezionare e cultura pulcino ganglio statoacoustic E4 ed E6 espianti midollo spinale. Espianti sono coltivate sotto siero senza condizioni in gel di collagene 3D per 24 ore. Reattività dei neuriti è testato con fattore di crescita integrata medie e con le proteine rivestite perline.
Abstract
Gli organi sensoriali dell'orecchio interno di pollo sono innervate dai processi periferici del ganglio statoacoustic (SAG) neuroni. Innervazione organo sensoriale dipende da una combinazione di segnali guida degli assoni 1 e fattori di sopravvivenza 2 situata lungo la traiettoria degli assoni in crescita e / o all'interno degli stessi obiettivi degli organi sensoriali. Per esempio, l'interferenza funzionale con un percorso classico di guida degli assoni segnalazione, semaforina-Neuropilin, generato misrouting di assoni otic 3. Inoltre, diversi fattori di crescita espresse negli obiettivi sensoriali dell'orecchio interno, compresi neurotrofina-3 (NT-3) e del fattore neurotrofico cervello derivato (BDNF), sono stati manipolati in animali transgenici, ancora una volta porta a misrouting di assoni SAG 4. Queste stesse molecole promuovere sia la sopravvivenza e la crescita dei neuriti dei neuroni SAG pulcino in vitro 5,6.
Qui, descriviamo e dimostrare il metodo in vitro stiamo ucantare per testare la reattività dei neuriti SAG pulcino alle proteine solubili, tra cui morfogeni noto come il Wnts, così come fattori di crescita che sono importanti per la promozione dei neuriti escrescenza SAG e la sopravvivenza dei neuroni. Usando questo sistema modello, speriamo di trarre conclusioni circa gli effetti che ligandi secreto può esercitare sulla sopravvivenza dei neuroni e SAG crescita dei neuriti.
Espianti SAG sono sezionato il giorno embrionale 4 (E4) e coltivate in gel tridimensionale di collagene sotto siero senza condizioni per 24 ore. In primo luogo, la reattività dei neuriti è testato da espianti coltura integrata con proteine di media. Poi, per chiedere se fonti puntuali di ligandi secreto può avere effetti direzionali sulla crescita dei neuriti, gli espianti sono co-coltura con le proteine rivestite perline e analizzati per la capacità del cordone di promuovere a livello locale o inibire escrescenza. Abbiamo anche una dimostrazione della dissezione (modificato protocollo 7) e la cultura della E6 espianti midollo spinale. Noiabitualmente uso espianti midollo spinale per confermare bioattività delle proteine e proteine-impregnati perline, e per verificare le specie reattività crociata con i tessuti pulcino, alle condizioni stessa cultura espianti SAG. Questi test in vitro sono utili per lo screening rapido per le molecole che esercitano trofico (sopravvivenza) o tropico (direzionale) effetti sui neuroni SAG, soprattutto prima di effettuare studi in vivo. Inoltre, questo metodo permette la sperimentazione di singole molecole sotto siero senza condizioni, con alta sopravvivenza dei neuroni 8.
Protocol
Discussion
Vi presentiamo un metodo per sezionare e cultura SAG E4 ed E6 espianti midollo spinale, da ragazza, sotto siero senza condizioni. Questa procedura è attualmente utilizzato nel nostro laboratorio per studiare gli effetti dei vari ligandi secreto SAG sulla sopravvivenza dei neuroni e crescita dei neuriti. Nuovi aspetti di questo protocollo includono l'uso di un siero privo di espianti di sistema per la coltura e l'uso di perline imbevute di fattori di crescita per studiare gli effetti sulla escrescenza SAG neurit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health di Grant RO1DC002756 e la Purdue Research Foundation. Ringraziamo Wu Doris e Wiese Chang per la consulenza con esperimenti e McPhail Rodney aiuto con figure.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
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| Dissection microscope |
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We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
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| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
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| Dissection Materials |
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| Sylgard© coated petri dish |
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| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
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| E4 and E6 chicken eggs |
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| Chick Ringer’s solution |
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Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
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| Collagen preparation |
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| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
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| Explant culture |
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| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
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| Immunohistochemistry |
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| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
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Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
References
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