神経突起伸長アッセイのためのコラーゲンゲルのチックStatoacousticガングリオンと脊髄の外植片の解剖と文化
Summary
我々はニワトリE4 statoacoustic神経節とE6脊髄の外植片を細かく分析し、文化に方法を示しています。外植片は、24時間3Dコラーゲンゲル中での無血清条件下で培養される。神経突起の応答性は、成長因子添加培地および蛋白質でコーティングされたビーズを使用してテストされています。
Abstract
鶏内耳の感覚器官はstatoacoustic神経節（SAG）ニューロンの末梢プロセスによって神経支配されています。感覚器官の神経支配は成長している軸索および/ またはそれらの感覚器官のターゲット内での軌道に沿って位置する軸索ガイダンスの手がかり1と生存因子2の組み合わせによって異なります。例えば、古典的な軸索 ガイダンスシグナル伝達経路、セマフォリン-ニューロピリン、との機能的な干渉が耳軸索の3の経路変更を生成。また、ニューロトロフィン-3（NT – 3）と脳由来神経栄養因子（BDNF）を含む、内耳の感覚目標で表現されるいくつかの増殖因子は、、再びSAGの軸索4の経路変更につながる、トランスジェニック動物で操作されている。これらの同じ分子は 、in vitro 5,6 でひよこのSAGの神経細胞の生存と神経突起伸長の両方を促進する。
ここで、我々は現在、Uなのin vitroの方法を説明し、実証既知のようなWntsなどのモルフォゲンだけでなく、SAGの神経突起伸長と神経細胞の生存を促進するための重要な成長因子を含む可溶性タンパク質、にひよこのSAGの神経突起の応答性をテストするために歌う。このモデルシステムを使用して、我々は、分泌配位子は、SAGのニューロンの生存と神経突起伸長に及ぼすことができる効果について結論を出すと思っています。
SAGの外植片は、胎生4（E4）で解剖し、24時間無血清条件下での三次元コラーゲンゲル内で培養されています。最初に、神経突起の応答性は、タンパク質含有培地で培養外植片によってテストされます。その後、分泌される配位子の点源が神経突起伸長に対する指向性の影響を持つことができるかどうか尋ねるために、外植片は、タンパク質でコーティングされたビーズと共培養し、局所的に伸長を促進または抑制するためにビーズの能力についてアッセイされています。我々はまた、E6脊髄の外植片の解剖のデモ（プロトコル7を変更）し、文化が含まれています。我々は日常的にタンパク質とタンパク質に浸したビーズの生物活性を確認するために、脊髄の外植片を使用し、SAGの外植片と同一の培養条件下で、ニワトリ組織で種の交差反応性を確認する。 in vitroアッセイこれらは、特にin vivoでの研究を実行する前に、迅速にSAGの神経細胞に栄養（生存）または熱帯（方向性）効果を発揮する分子をスクリーニングするのに便利です。また、この方法は高いニューロンの生存8で、無血清条件下での個々の分子のテストが可能。
Protocol
Discussion
我々は、無血清の条件下で、ひよこから、E4のSAGとE6脊髄の外植片を細かく分析し、文化に方法を提示する。このプロシージャは、現在SAGのニューロンの生存と神経突起伸長に対する様々な分泌配位子の効果を研究する私たちのラボで使用されています。このプロトコルの小説の側面は、培養の外植片とSAGの神経突起伸長への影響を研究する成長因子を染み込ませたビーズの使用のための無血…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、健康グラントRO1DC002756とパデュー研究財団の国民の協会によって資金を供給された。我々は、実験と数値のヘルプについてはロドニーのマクフェイルとのアドバイスをドリス呉とWieseのチャンに感謝する。
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
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| Dissection microscope |
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We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
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| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
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| Dissection Materials |
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| Sylgard© coated petri dish |
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| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
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| E4 and E6 chicken eggs |
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| Chick Ringer’s solution |
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Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
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| Collagen preparation |
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| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
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| Explant culture |
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| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
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| Immunohistochemistry |
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| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
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Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
References
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