نحن نقدم طريقة لاستخدام MALDI قياس الطيف الكتلي والاختزالية الكيمياء مثيلة لقياس التغيرات في مثيلة ليسين.
Abstract
مؤخرا، تم اكتشاف المنظمين جينية واللاعبين الرئيسيين في العديد من الأمراض المختلفة 1-3. ونتيجة لذلك، هذه الانزيمات من الاهداف الرئيسية لدراسات جزيء صغير والمخدرات 4 التنمية. المنظمين جينية كثيرة في الآونة الأخيرة فقط تم اكتشاف و لا تزال في طور تصنيفها. من بين هذه الانزيمات هي demethylases ليسين التي إزالة مجموعات الميثيل من lysines على histones والبروتينات الأخرى. نظرا لطبيعة رواية من هذا النوع من الانزيمات، وقد وضعت بعض المقايسات لدراسة نشاطها. وكان هذا كتلة الطريق إلى تصنيف كل من وعالية الإنتاجية من الدراسة demethylases هيستون. حاليا، المقايسات demethylase عدد قليل جدا من الوجود. تلك التي لا توجد تميل الى ان تكون ذات طابع نوعي، ولا يمكن تبين في وقت واحد بين الولايات مثيلة ليسين مختلفة (الامم المتحدة، أحادي، ثنائي وثلاثي). ويشيع استخدام الطيف الكتلي لتحديد نشاط demethylase ولكن هل الحالي المقايسات الطيفي الشامللا تتناول ما إذا الببتيدات ميثليته تفاضلي تأين بشكل مختلف. التأين الفرق من الببتيدات ميثليته يجعل من الصعب المقارنة بين الولايات مثيلة وبالتأكيد ليس كمي (الشكل 1A). وبالتالي ليست الأمثل المقايسات المتاحة لتحليل شامل للنشاط demethylase.
نحن هنا وصف طريقة تسمى MassSQUIRM (تحديد الكميات الطيفي الشامل باستخدام مثيلة الاختزالية النظائر) والتي تقوم على مثيلة الاختزالية للجماعات أمين مع الفورمالدهيد deuterated لاجبار جميع lysines ليكون ثنائي ميثليته، مما يجعلها أساسا الأنواع الكيميائية نفسها، وبالتالي تأيين نفس (الشكل 1B). الفرق الكيميائية فقط بعد مثيلة الاختزالية هو الهيدروجين والديوتيريوم، الذي لا يؤثر على الكفاءة التأين MALDI. الفحص MassSQUIRM غير محددة لمنتجات التفاعل مع demethylase lysines الامم المتحدة، أحادية أو ثنائي ميثليته. الفحص ينطبق أيضا على methyltransferases يسين إعطاء SAلي منتجات التفاعل. هنا، ونحن نستخدم مزيج من الكيمياء مثيلة الاختزالية وMALDI مطياف الكتلة لقياس نشاط LSD1، وهو demethylase يسين قادر على إزالة ثنائي وأحادي الميثيل الجماعات، على ركيزة الببتيد الاصطناعية 5. هذا الفحص بسيط وقابلة بسهولة إلى أي مختبر مع الوصول إلى مطياف الكتلة MALDI في المختبر أو من خلال مرفق البروتيوميات. الفحص له ~ 8 أضعاف نطاق الدينامية وغير قابلة للتطوير بسهولة على شكل لوحة 5.
Protocol
يتم تعديل هذا البروتوكول من بلير وآخرون. 6. 1. LSD1 نزع الميثيل الفحص في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر، والجمع بين 125 نانوغرام LSD1 المؤتلف مع 0.25 ميكروغرام ثنائي الميثيل الببتي?…
Discussion
MassSQUIRM هي طريقة غير مكلفة والكمية لتحليل شامل لنشاط demethylases يسين المشاركين في أحادية و ثنائي مثيلة. MassSQUIRM تقدم الكميات ليس فقط من نتاج رد فعل، بل أيضا من أجل وسيطة. ويمكن استخدام هذا الاختبار باعتبارها أداة قوية في دراسة آلية demethylases هيستون LSD1 وغيرها. وسوف يكون من المفيد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مرفق البروتيوميات UAMS الطيفي للحصول على الدعم الشامل. وقدم التمويل لهذا المشروع من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة P20RR015569، P20RR016460 وR01DA025755.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
LSD1
BPS Biosciences
50100
H3K4me2-biotin peptide
prepared in-house
none
POROS R2 20 micron beads
Applied Biosystems
1-1129-06
C18 ZipTip
Millipore
ZTC18M
Trifluoroacetic acid (TFA)
Thermo
28904
acetonitrile
Fisher
A996
2,5-dihydroxybenzoic acid
Sigma
85707
Borane dimethylamine
Sigma
180238
isotopically heavy d2-formaldehyde
Cambridge Isotope Laboratories
DLM-805-20
Tris
Fisher
BP154
KCl
Fisher
BP366
MgCl2
Fisher
BP214
Glycerol
Fisher
G33
Formic acid
Fluka
06440
Methanol
Fisher
A452
Na-phosphate
Fisher
BP329
SpeedVac Concentrator
Savant
DNA110
MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software
Blair, L. P., Avaritt, N. L., Tackett, A. J. Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity. J. Vis. Exp. (61), e3604, doi:10.3791/3604 (2012).