אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.
Abstract
לאחרונה, הרגולטורים אפיגנטים המשנים התגלו כשחקנים מרכזיים מחלות רבות ושונות 1-3. כתוצאה מכך, אנזימים אלה הם מטרות הממשלה ללימודי מולקולה קטנה ועל פיתוח 4 תרופות. הרגולטורים אפיגנטים המשנים רבים יש רק לאחרונה התגלה, והם עדיין בתהליך של להיות מסווג. בין אנזימים אלה הם demethylases ליזין אשר הסרת קבוצות מתיל מ lysines על ההיסטונים וחלבונים אחרים. בשל אופיו של הרומן המעמד הזה של אנזימים, מבחני כמה פותחו כדי ללמוד על פעילותם. זה היה מחסום הסיווג והן במחקר קצב העברת נתונים גבוה של demethylases היסטון. נכון לעכשיו, מבחני demethylase מעט מאוד קיים. אלה אכן קיימים נוטים להיות איכותית בטבע ולא ניתן להבחין בו זמנית בין מדינות שונות מתילציה ליזין (האו"ם, מונו, די ו-Tri-). ספקטרומטריית מסה משמש בדרך כלל כדי לקבוע פעילות demethylase אבל הנוכחי מבחני ספקטרומטריה לעשותלא לענות אם פפטידים מפוגל דיפרנציאלי ליינן אחרת. יינון ההפרש של פפטידים מפוגל עושה השוואה בין מדינות מתילציה קשה ובוודאי לא כמותית (איור 1 א). לכן מבחני כניסה אינן מותאמות ניתוח מקיף של פעילות demethylase.
כאן אנו מתארים שיטה הנקראת MassSQUIRM (quantitation ספקטרומטריה באמצעות מתילציה רדוקטיבי איזוטופי) המבוסס על מתילציה רדוקטיבי של קבוצות האמין עם פורמלדהיד deuterated לכפות lysines כל להיות DI-מפוגל, ולכן מה שהופך אותם למעשה המין כימי ולכן ליינן אותו (1B איור). ההבדל הכימי רק לאחר מתילציה רדוקטיבי הוא מימן דאוטריום, אשר אינו משפיע על יעילות MALDI יינון. Assay MassSQUIRM הוא ספציפי עבור תוצרי התגובה demethylase עם lysines האו"ם, מונו או di-מפוגל. Assay גם לגבי methyltransferases ליזין נותן SAלי תוצרי התגובה. כאן, אנו משתמשים בשילוב של כימיה מתילציה רדוקטיבי ו ספקטרומטריית MALDI המונית כדי למדוד את הפעילות של LSD1, demethylase ליזין מסוגלת להסיר DI-וחד-methyl קבוצות, על מצע פפטיד סינתטי 5. Assay זה פשוט נוח בקלות למעבדה כל גישה ספקטרומטר מסה MALDI במעבדה או באמצעות מתקן proteomics. Assay יש ~ 8 פי טווח דינמי והוא ניתן להרחבה בקלות לעצב צלחת 5.
Protocol
פרוטוקול זה הוא שונה מן בלייר ואחרים. 6. 1. LSD1 demethylation Assay בכרך האחרון של μL 20, לשלב 125 LSD1 רקומביננטי ng עם 0.25 di-methyl מיקרוגרם היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין) במאגר demethylase (…
Discussion
MassSQUIRM היא שיטה זולה כמותית לניתוח מקיף של פעילותו של demethylases ליזין המעורבים מונו ו מתילציה-di. MassSQUIRM מציע quantitation לא רק של המוצר התגובה אלא גם את התשומות. Assay זה יכול לשמש ככלי רב עוצמה בחקר מנגנון demethylases היסטון LSD1 אחרים. זה יהיה גם שימושי לסיווג אנזימים רבים שהתגלו לאחרו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים UAMS Proteomics מתקן לתמיכה ספקטרומטריה. המימון לפרויקט זה סופק על ידי NIH מענקים P20RR015569, P20RR016460 ו R01DA025755.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
LSD1
BPS Biosciences
50100
H3K4me2-biotin peptide
prepared in-house
none
POROS R2 20 micron beads
Applied Biosystems
1-1129-06
C18 ZipTip
Millipore
ZTC18M
Trifluoroacetic acid (TFA)
Thermo
28904
acetonitrile
Fisher
A996
2,5-dihydroxybenzoic acid
Sigma
85707
Borane dimethylamine
Sigma
180238
isotopically heavy d2-formaldehyde
Cambridge Isotope Laboratories
DLM-805-20
Tris
Fisher
BP154
KCl
Fisher
BP366
MgCl2
Fisher
BP214
Glycerol
Fisher
G33
Formic acid
Fluka
06440
Methanol
Fisher
A452
Na-phosphate
Fisher
BP329
SpeedVac Concentrator
Savant
DNA110
MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software
Blair, L. P., Avaritt, N. L., Tackett, A. J. Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity. J. Vis. Exp. (61), e3604, doi:10.3791/3604 (2012).