Tissue mikromatriser åpner for en effektiv metode for å få samtidige informasjon fra et mangfold av vev. Representative deler av vev settes sammen til ett parafin blokk. Seksjoner fra blokken brukes til immunhistokjemi og analyse av protein expression mønstre. Digital skanning genererer tilsvarende bilder for distribusjon av data.
Vevet microarray (TMA) teknologi som sørger for høy gjennomstrømming analyse av flere vev og celler. Teknikken brukes innen Human Protein Atlas prosjekt for global analyse av protein expression mønstre i normal menneskelig vev, kreft og cellelinjer. Her presenterer vi montering av 1 mm kjerner, hentet fra mikroskopisk utvalgte representative vev, i en enkelt mottaker TMA blokk. Antallet og størrelsen på kjernene i en TMA blokk kan varieres fra ca førti 2 mm kjerner til hundrevis av 0,6 mm kjerner. Fordelen med å bruke TMA teknologi er at store mengder data kan raskt hentes ved hjelp av en enkelt farging protokoll for å unngå eksperimentell variasjon. Viktigere er bare begrenset av knappe vev nødvendig, noe som åpner for analyse av store pasientgrupper kohorter 1 2. Rundt 250 påfølgende seksjonene (4 mikrometer tykk) kan bli kuttet fra en TMA blokk og brukes for immunhistokjemisk staining å bestemme bestemt protein expression mønstre for 250 forskjellige antistoffer. I Human Protein Atlas-prosjektet, er antistoffer genereres mot alle menneskelige proteiner og brukes til å skaffe tilsvarende protein profiler i både normal menneskelig vev fra 144 individer og kreft vev fra 216 forskjellige pasienter, som representerer de 20 vanligste former for menneskelig kreft. Immunohistochemically beiset TMA seksjoner på glassplater blir skannet for å lage bilder med høy oppløsning som patologer kan tolke og kommentere utfallet av immunhistokjemi. Bilder sammen med tilsvarende patologi-baserte merknadsverktøy data gjøres offentlig tilgjengelig for forskningsmiljøet gjennom menneskerettsloven Protein Atlas portal ( www.proteinatlas.org ) (figur 1) 3 4. The Human Protein Atlas gir et kart som viser fordeling og relativ overflod av proteiner i menneskekroppen. Den nåværende verSion inneholder over 11 millioner bilder med protein expression data for 12.238 unike proteiner, tilsvarende mer enn 61% av alle proteiner kodet av det menneskelige genom.
Immunhistokjemi er den klart mest brukte programmet for TMA. Kombinasjonen av IHC og TMA kan brukes i flere forskjellige innstillinger, f.eks high-throughput screening av protein expression mønstre i vev 7 8 og celler 9 10, biomarkører studier basert på vevsprøver fra store pasientgrupper årskull 11 12 og mer grunnleggende tumorbiologi studier, blant annet forskjellige fenotyper / genotyper, derivasjon scener, progresjon og metastasering 13. En fordel med å bruke TMA er at materiale fra store årskull kan analyseres på en gang, og sparer både verdifull biologisk materiale og sikre mer reproduserbare eksperimenter. Dessuten sparer bruk av TMA-teknologi på reagensbeholdere kostnader og laboratorium saksbehandlingstiden. Som en TMA bare inneholder en begrenset mengde vev, er vev heterogenitet et problem. Avhengig av hvilken type vev og spørsmål tas opp, kan flere prøver være nødvendig fra samme specimen. For tumorvev, er bruken av to til fire kjerner fra hver prøve anbefalt som det har vist seg å resultere i en høy grad av nøyaktighet i representasjon av hele vevsdelene 13 14. Avhengig vevssammensetning diameteren på slag (alt fra 0,6 mm til 2 mm) kan justeres. Vev er komplekse og består av både flere forskjellige celletyper, strukturer og ekstra-cellulær matriks. Sammensetningen av hver forskjellig vevstype som inneholder variabel mengde fett, vil blodårer, bindevev, brusk etc., påvirker trykket som trengs for punching og samle separate kjerner. Det er derfor av betydning å praktisere alle trinnene i prosedyren på materiale som ikke er av noen verdi, før produsere en TMA med definerte vev for de planlagte forsøkene.
Når seksjonering en rekke forskjellige vev innenfor en TMA blokk sammensetningen av blokken kunne påvirke evnen til å tilegne seg høy kvalitet seksjoner. Certain vev, f.eks hud, benmarg, fett, hjerne og bryst, gjengi Seksjonering av TMA-blokken vanskelig på grunn av forskjeller i tekstur som påvirker hvordan seksjoner strekke ut i vannbad og hvordan ulike hardhet er kuttet av bladet etc. Det anbefales derfor å gruppere vev med tilsvarende funksjoner f.eks lipid rik vevet inn en TMA, når dette er aktuelt. Flertallet av kreft vev er i denne forstand homogen, letter som seksjonering av kreft TMA. En alternativ seksjonering metode for å stabilisere microarray kjerner kan være ansatt ved håndtering en TMA med heterogene typer vev. Bruken av en tape kan være nyttig for å unngå tap av kjerner og fall-out i seksjoneres TMA. Bruk av teip bør benyttes med forsiktighet, ettersom tapen kan påvirke tykkelsen av seksjonert kjerner og senere også utfallet av IHC farging 15. I Human Protein Atlas satt opp en TMA mal av 9×8 (unntatt markører) kjerner are brukt. Det er viktig å få maksimal antall seksjoner og holder alle vev er representert i hele blokken. For å lagre reagenser og skanning tid, er 2 seksjoner plasseres på en glass-slide gir maksimal mal av 9×8.
Den store repository for protein informasjon, omfatter Universal Protein Resource 16 lag 20.300 anmeldt menneskelig protein oppføringer, hvorav bare ca 66% har bevis på protein-nivå. Også for et flertall av de gener som det er bevis for eksistens på protein-nivå, er det lite eller ingen informasjon om protein funksjon og distribusjon av uttrykk. En viktig utfordring for fremtiden er å analysere fordelingen mønster og relativ overflod av disse ukjente proteiner i ulike typer menneskelig vev. Informasjonen fra databaser som Uniprot, ENSEMBL, publiserte data fra PubMed kan brukes som en guide for å fastslå om immunhistokjemisk farging mønstre ved hjelp av antistoffer motsengeposter ukjente proteiner representerer faktiske protein profiler av den tiltenkte målet protein. I tillegg er flere andre validering strategier for å sikre antistoff funksjonalitet, for eksempel antistoff funksjonalitet i protein matriser, Western blot, immunfluorescens, immun-nedbør og trekk-ned eksperimenter. Kanskje det viktigste verktøyet for validering av antistoff funksjonalitet er å bruke sammenkoblede antistoffer, dvs. to forskjellige antistoffer reist mot egne, ikke-overlappende epitoper på samme målet protein, for å sammenligne analysen-bestemt utfall 17.
Basert på samlet opplysninger, er antistoffer testet og titreres etter IHC standarder og erfaring fra testing og validere enn 35.000 antistoffer i humant protein Atlas-prosjektet. For over 20% av alle gener med protein profiler, har data fra sammenkoblede antistoffer (2 eller flere antistoffer mot ikke-overlappende epitoper på samme protein) blitt brukt for å avgjøre en best mulig anslagkompis av tilsvarende protein uttrykk mønster. Sammenkoblede antistoffer gir en ultimate strategi for validering av spesifikke immunhistokjemi-baserte protein expression mønstre. Denne strategien er verdifullt fordi det mangfold av ulike vev som inngår i den grunnleggende screening øker risikoen for kryssreaksjon. Det bør også bemerkes at visse vev er generelt mer utsatt for å vise bakgrunnen flekker f.eks makrofager, glatte muskelceller, distal tubuli i nyrene og leverceller i leveren. Ytterligere spørsmål å vurdere omfatte variasjoner i vevet behandling teknikker over tid for de vev tatt fra arkivmateriale, noe som kan resultere i falske negative eller upassende positive IHC flekker mønstre. Dette fenomenet er også påtruffet i stor seksjon analyse. Både negative og positive kontroller er viktig og bør brukes når det er mulig. For dypere studier inkludert funksjonelle analyser, cellelinjer med tvang uttrykk og spesifikk knock-down av tilsvarende transcripts (siRNA-teknologi) kan brukes til å opprette kontroller. For optimale resultater i IHC, er det viktig å teste og bruke antigen datasystemer siden formalin fiksering induserer ulike kjemiske modifikasjoner f.eks cross-linking, hydrolyse av Schiff baser som maskerer antigen 18.
I konklusjonen, er antistoff-baserte proteomikk ansette TMA teknologi og IHC en kraftig strategi for å generere protein uttrykk data i stor skala. The Human Protein Atlas-prosjektet har blitt satt opp for å lage et kart over menneskelig protein uttrykk i normal menneskelig vev og kreft. Målet med dette prosjektet er å presentere et første utkast til en omfattende menneskelig protein Atlas innen 2015. I tillegg til å gi protein profiler i normale organer og vev, gir dette arbeidet også et utgangspunkt for biomedisinske forskningsprosjekter, herunder kliniske biomarkører innsats. Det ultimate målet er å legge til en neste opplysninger lag på toppen av det menneskelige genom sekvens som wivil være avgjørende for en dypere forståelse av biologi underliggende ulike sykdomstilstander, og gi et grunnlag for å utvikle nye diagnostiske og terapeutiske verktøy.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Knut og Alice Wallenberg Foundation. Hele staber av Human Protein Atlas sentre i Uppsala, Stockholm og India er anerkjent for sin innsats for å generere Human Protein Atlas. Forfatterne ønsker å spesielt takke Frank Hammar og Sofie Gustafsson for hjelp med bilder og Elene Karlberg for hjelp med TMA produksjonen når filming.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Wash buffer | Thermo Fisher Scientific | TA-999-TT |
Citrate buffer pH6 | Thermo Fisher Scientific | TA-250-Pm1X |
Antibody diluent | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UD |
UltraVision LP HRP polymer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-HL |
DAB plus substrate system | Thermo Fisher Scientific | TA-125-HDX |
Ultra V Block | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UB |
Primary Antibody Enhancer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-PB |
Mayers hematoxylin | Histolab | 01820 |
PERTEX | Histolab | 00871.0500 |
Name of the equipment | Company | Catalogue number |
Manual tissue micro arrayer | Estigen, Beecher Instrument | MTA-1 |
Waterfall microtome | Thermo Fisher Scientific | Microm HM 355S |
Automated image scanner | Aperio Technologies | XT |
Automated slide staining system | Thermo Fisher Scientific | Autostainer 480S-2D |
Automated slide staining system for deparafinization and dehydration | Leica Biosystems | Autostainer XL |
Automated glass coverslipper | Leica Biosystems | CV5030 |
Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2008INTEL |