इस विधि H1N1 के एक उच्च संवेदनशीलता पर bronchioalveolar पानी से धोना (बाल) के संक्रमित चूहों के तरल पदार्थ में पता लगाने के लिए इन्फ्रारेड डाई आधारित इमेजिंग प्रणाली का उपयोग का वर्णन करता है. 96 एक में इस पद्धति का प्रदर्शन किया जा सकता है – या थाली 384 अच्छी तरह से, <10 परीक्षण सामग्री का μl मात्रा की आवश्यकता है और कई रोगजनकों के समवर्ती स्क्रीनिंग के लिए क्षमता है.
Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.
दक्षिण पूर्व एशिया में बर्ड फ्लू और स्वाइन फ्लू महामारी के एक वैश्विक डर की हाल ही में महामारी फैलने के सार्वजनिक स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए भारी चिंताओं थोपना. इन्फ्लूएंजा वायरस के मौजूदा और नए उपभेदों के लिए टीके पैदा करने में महत्वपूर्ण ध्यान केंद्रित समर्पित किया गया है. सटीक पता लगाने और सही वायरल अनुमापांक गणना के लिए तेजी से उच्च प्रौद्योगिकी की उपलब्धता काफी उपचार में सुधार होगा. सबसे अधिक इस्तेमाल करने के लिए वायरस अनुमापांक गणना कार्यरत तकनीक पट्टिका गठन और इन्फ्लूएंजा hemagglutination assays शामिल हैं. पट्टिका गठन परख पहले जीवाणुभोजी titers का अनुमान करने के लिए विकसित किया गया था और Renato Dulbecco द्वारा अपनाई पशु वायरल titers 4 गणना. इस परख प्रदर्शन करने के लिए, इन्फ्लूएंजा शेयर या बाल तरल पदार्थ के रूप में पशु नमूनों के 10 गुना dilutions के लिए तैयार कर रहे हैं और 6 अच्छी तरह से प्लेट में 0.1 मिलीलीटर aliquots MDCK कोशिकाओं की monolayer पर inoculated हैं. वायरस MDCK विज्ञापन के बाद कोशिकाओं पर सोखना करने के लिए अनुमति दी गई हैएक पोषक मध्यम और agarose के प्रत्यर्पण. ऊष्मायन के दौरान, मूल संक्रमित कोशिकाओं वायरल संतान है कि केवल पड़ोसी कोशिकाओं में फैल जारी है. इन्फ्लूएंजा वायरल संक्रमण के कोशिकाविकृतिजनक प्रभाव संक्रमित कोशिकाओं के एक परिपत्र क्षेत्र एक पट्टिका बुलाया पैदा करता है. प्रत्येक पट्टिका संभवतः एक वायरस वायरस की प्रतिकृति के बाद कण के साथ एक एकल कोशिका के संक्रमण के बाद बनाई है. जीवित कोशिकाओं और सजीले टुकड़े के बीच इसके विपरीत जैसे क्रिस्टल बैंगनी रंगों से बढ़ाया जा सकता है. इस परख की एक बड़ी खामी reproducibility और प्रयोगों के भीतर भारी बदलाव की कमी है. एक और के लिए इन्फ्लूएंजा वायरल अनुमापांक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया परख hemagglutination परख है. hemagglutinin प्रोटीन इन्फ्लूएंजा वायरस की सतह पर मौजूद कुशलतापूर्वक एन acetylneuraminic स्तनधारी और एवियन लाल रक्त कोशिकाओं को एक एसिड युक्त प्रोटीन को बांधता है. इन्फ्लूएंजा वायरस और एरिथ्रोसाइट्स के बीच यह बातचीत एक जाली के रूप में समूहन की ओर जाता है. मैंसमूहन की Evel परीक्षण नमूनों में इन्फ्लूएंजा वायरस की अनुमापांक का अनुमान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एरिथ्रोसाइट समूहन परख ही प्रयोग किया जाता है एक ज्ञात वायरस का अनुमापन निर्धारित करने के लिए और तनाव पहचान प्रयोजनों के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है. इस परख के बाद से रहते हैं और मृत वायरस के बीच अंतर नहीं है, यह मुश्किल है वायरल titers का एक सटीक गणना प्राप्त है.
इन्फ्लूएंजा संक्रमण के वर्तमान नैदानिक निदान serologic परीक्षण, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, प्रत्यक्ष नमूना immunofluorescence और सेल 1,6 संस्कृति पर आधारित हैं. नई विधि यहाँ वर्णित भी नैदानिक और प्रयोगशाला नैदानिक संभावित है. इन्फ्लुएंजा का पता लगाने किट Directigen फ्लू ए (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, सीए) और (Binax इंक, स्कारबोरो, इ) उपयोग immunochromatography परख BinaxNow nucleoprotein 7 के रूप में वायरल प्रतिजन पता लगाने के. ये किट का उपयोग वायरस का पता लगाने के 15 मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है, तथापि, सभी नकारात्मक नमूने आगे हैसेल संस्कृति विधि द्वारा creened. विभिन्न अध्ययनों से यह भी इन किटों की कम संवेदनशीलता, विशेष रूप से, जब संक्रमण हल्के या कम 8 था की सूचना दी है. हमारे विधि में, हम लगातार वायरस का पता लगाने के रूप में कम के रूप में 100 pfu. यह पता चलता है हमारे तकनीक नैदानिक नमूनों में H1N1 वायरस का पता लगाने में उपयोगी है, तब भी जब संक्रमण हल्का है. एक प्रतिदीप्ति आधारित विधि वायरल एंटीजन का पता लगाने के लिए बताया गया है, जहां या तो nasopharyngeal महाप्राण (व्यंजन) नमूनों को सीधे या विश्लेषण किया गया वायरस गुणा और बाद में विश्लेषण 9 के लिए अतिसंवेदनशील कोशिकाओं की एक monolayer पर टीका. हालांकि, इन तरीकों नैदानिक प्रयोजनों के लिए सीमित कर रहे हैं और वायरस अनुमापांक गणना के लिए उपयुक्त नहीं हैं. क्यू पीसीआर वायरल शाही सेना की उपस्थिति की पहचान करने में मदद करता है और रहते वायरस की संक्रामकता का अनुमान नहीं है. इन assays के लिए की तुलना में, आईआर परख डाई आधारित प्रणाली का पता लगाने और नैदानिक और प्रयोगशाला नमूनों में वायरल अनुमापांक के गणना में मदद मिलेगी. इन्फ्लूएंजा प्रकोप के मामले में, यह हैएक कम समय अवधि में नमूने के हजारों का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे 384 अच्छी तरह से थाली और आईआर स्कैनर के आधार पर विधि एक समय (> 2000 नमूनों) में 6 प्लेट स्कैन, इसलिए अन्य प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट तरीकों पर एक बड़ा लाभ की पेशकश कर सकते हैं. नैदानिक नमूनों के हजारों की तेजी से प्रसंस्करण की व्यवहार्यता परीक्षण परख समय और लागत की लंबाई, परिवर्तनशीलता को कम कर सकता है. M2-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग एच एन और प्रोटीन में तनाव मतभेद के स्वतंत्र होने का लाभ प्रदान करता है. प्रोटीन M2 अपेक्षाकृत सबसे इन्फ्लूएंजा संक्रमण मनुष्यों उपभेदों में संरक्षित है. यदि परिसंचारी दाग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी हमारी प्रणाली के साथ संयुक्त कर रहे हैं एक वायरस की दोनों अनुमापांक उपाय और तनाव की पहचान कर सकते हैं. हालांकि, के बाद से M2 के Amantadine की तरह दवाओं के लिए लक्ष्य है, म्यूटेंट पैदा कर सकते हैं कि यहां इस्तेमाल किया MAB के लिए बाध्यकारी साइट बदल सकता है. यह व्यक्तियों, जो इन दवाओं से इलाज किया जा रहा में इस प्रणाली के लिए एक संभावित सीमा का प्रतिनिधित्व करता है.
विभिन्नassays के लिए परीक्षण के नमूने में इन्फ्लूएंजा titers की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. वायरस अनुमापांक, 50% टिशू कल्चर संक्रामक खुराक (50 TCID) और अंडे द्रव्य आधारित assays व्यापक रूप से गणना 1,10 उपयोग किया जाता है. हालांकि, कई दिनों की आवश्यकताओं को इन तरीकों कम विश्वसनीय बनाते हैं. इसके अलावा, इन तरीकों में सजीले टुकड़े की संख्या में 50% परिवर्तन पर आधारित गणना सैद्धांतिक लेकिन नहीं सही वायरल titrations प्रदान करते हैं. फलक assays के गठन के 96 घंटे के भीतर किया जा सकता है, तथापि, reproducibility के अभाव वायरल अनुमापांक गणना में एक प्रमुख चिंता का विषय है. वर्तमान तकनीक यहाँ वर्णित कई अलग फायदे हैं. सबसे पहले, यह संगत परिणामों के साथ एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक है. दूसरा, वायरल अनुमापांक गणना प्रतिदीप्ति तीव्रता है कि परिभाषित मानक घटता के खिलाफ तुलना कर रहे हैं सरल मात्रा का ठहराव के आधार पर कर रहे हैं. तीसरा, दो या दो से अधिक प्राथमिक एंटीबॉडी किसी नमूने में कई सीरमप्रकारों निदान किया जा सकता है. इसके अलावा, आईआर डाई संयुग्मित एंटीबॉडी एक राग हैअल autofluorescence और 11 इमेजिंग सेल के लिए इस्तेमाल किया गया है. उच्च सेलुलर उच्च मात्रा उपज अंतर्जात fluorophores की उपस्थिति के कारण autofluorescence में यूवी या दृश्य विकिरण परिणाम (300-600 एनएम). खुशबूदार एमिनो एसिड, लाइपो – pigments के है, pyridinic nucleotides (NADPH), elastin, कोलेजन और पीला रंग coenzymes शामिल हैं. कोशिकाओं के इस आंतरिक संपत्ति यह विकिरण के इन स्रोतों का उपयोग करने के लिए मुश्किल के रूप में जांच विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति मात्रा ठहराना करने के लिए बनाता है. इसके विपरीत में, पास आईआर रंगों को उत्तेजित और 670-1000 एनएम के बीच फेंकना. कई मेजबान सेलुलर अणुओं और polyaromatic हाइड्रोकार्बन इस तरंग दैर्ध्य में नहीं उत्तेजित और कम रोशनी बिखरने के कारण, बहुत कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति फेंकना. इसके अलावा, पृष्ठभूमि और विशिष्ट पहचान के बीच खिड़की बेहद पास IR fluorophores के एक उच्च विलुप्त होने गुणांक की वजह से सुधार हुआ है. Photostability, बेहतर संकेत करने के लिए शोर अनुपात, वायरल titers की मात्रा का ठहराव में अत्यंत प्रासंगिक है. Microfl का प्रयोग करेंuidic कक्षों रोबोट नियंत्रण के माध्यम से जांच प्रक्रिया को स्वचालित करेगा और हमें आसानी से अत्यधिक संक्रामक नैदानिक नमूनों का परीक्षण करने के लिए अनुमति दे सकता है. इस प्रकार, इन तरीकों में पास आईआर रंगों के उपयोग आदर्श और अत्यधिक विश्वसनीय ऊतकों के नमूनों में वायरल titers की गणना है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के भाग एनआईएच R01 A1064826 01 अनुदान, U19 AI062627-01, No1 – HHSN26600500032C (एस.एम. के लिए) में समर्थित है. हम चर्चा और तकनीकी मदद के लिए हमारी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए टीना Heil. हम के डेविड बीना, मिलवॉकी स्वास्थ्य विभाग प्रयोगशाला वायरस संस्कृति और पीसीआर के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR-biosciences | 9201-01 | |
384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |