Bananfluen,<em> Drosophila melanogaster</em>, Udvider sine snabel til fodring, reagere på en sukker stimulus fra sine snabel eller tarsus. Jeg har kombineret observationer af snabel forlængelsen respons (PR) med en calcium imaging teknik, hvilket giver os mulighed for at overvåge aktiviteten af neuroner i hjernen, samtidig med adfærdsmæssige observation.
At studere neuronale netværk i forhold til deres funktion i adfærd, må vi analysere, hvordan neuroner fungerer, når hver adfærdsmønster er genereret. Således samtidige optagelser af neuronal aktivitet og adfærd er afgørende for at korrelere hjernens aktivitet til adfærd. For sådanne adfærdsmæssige analyser giver frugtflue, Drosophila melanogaster, os at inkorporere genetisk indkodede calcium indikatorer såsom GCaMP 1 til overvågning af neuronal aktivitet, og at anvende avancerede genetiske manipulationer for optogenetic eller thermogenetic teknikker til specifikt at aktivere identificeret neuroner 2-5. Anvendelse af en thermogenetic teknik har ført os til at finde kritiske neuroner til fodring adfærd (Flood et al., Er under revision). Som en væsentlig del af spiseadfærd, strækker sig en Drosophila voksen dens snabel til fodring 6 (snabel forlængelse respons, PER), svarer til en sød stimulus fra sanseceller på dens snabel eller tarsi. Combining protokollen for PER 7 med en calcium imaging teknik, 8 ved hjælp GCaMP3.0 1, 9, har jeg oprettet et eksperimentelt system, hvor vi kan overvåge aktiviteten af neuroner i fodringen centrum – suboesophageal ganglion (SOG), samtidig med adfærdsmæssige observation De proboscis. Jeg har udviklet et apparat ("Fly hjerne aktuel Imaging og Elektrofysiologi Stage": "flyver") til at rumme en Drosophila voksen, så dets proboscis frit bevæge sig, mens dens hjerne udsættes badet for Ca2 +-billeddannelse gennem en nedsænkning i vand linse . Fluerne er også velegnet til mange typer af levende eksperimenter på Fly hjerner som elektrofysiologiske optagelse eller tidsforskydningen billeder af synaptisk morfologi. Idet resultaterne fra levende billeddannelse kan korreleres direkte med den samtidige PER adfærd, kan denne metode giver et fremragende eksperimentelle system til at undersøge information behandling af neurale netværk, og hvor det Cellular aktivitet er koblet til plast processer og hukommelse.
Fluerne muliggør samtidig optagelse af Ca2 +-signaler og PR adfærd. Selv med hjernen udsættes for saltvand normal PER adfærd blev observeret. Brug af Gampi-Washi væge i stedet for en Kimwipe væge anvendt i den oprindelige kapillarrøret method7 letter en meget reproducerbar og stabil PER adfærd og undgår behovet for at blive uddannet i at gøre og vælge en god Kimwipe væge. De eksperimentelle spidser anført ovenfor tillod os at kunne undgå forstyrrelser ved bevægelse af proboscis, hvilket fører til en meget stabil optagelse af Ca 2 +-signaler med lav støj. Lejlighedsvis fjernelse af væv ikke var tilstrækkelig til at udsætte celler eller undertrykke bevægelse tilstrækkeligt, hvilket fører til dårlige resultater. Men, når vi var dygtige, mere end 80% af præparater givet gode resultater. Denne metode er ikke blot for Ca2 +-billeddannelse, men kan også tilpasses til alle levende billeddannelse under iagttagelse PER adfærd. For eksempel kan man få adgang til en celle viaanvendelse af en elektrode til direkte optagelse aktivitet. Kombineret med to-foton excitering mikroskopi, er vi i stand til at udføre tidsforløb billeddannelse af synaptisk struktur, som kan relateres til adfærdsændringer. Derfor er denne fremgangsmåde til billeddannelse af hjernen med adfærdsmæssige observationer er ikke kun værdifuld for den funktionelle dissektion af neurale netværk, men kan anvendes som et effektivt middel til at korrelere synaptisk plasticitet 14 til mekanismerne bag hukommelse.
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker L Watanabe, M Gorczyca og andre medlemmer af Yoshihara laboratoriet for nyttige kommentarer og diskussion. Jeg takker K. Scott og L. Looger for flyve aktier, S Yokoyama til demonstration eksperimenter, Shinya Iguchi for teknisk hjælp, og Nobuko Yoshihara for væsentlige oplysninger. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Mental Health Tilskud MH85958, og Worcester Foundation til MY
Name of Equipment/Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
BX51WI Microscope | Olympus | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
Spinning disk confocal microscope system | Improvision in PerkinElmer | With 491 nm laser | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2″ 1080 × 960 pixels SONY CCD |
Joystick manipulator | Narishige | MN-151 | |
Injector | Narishige | IM-5B |