पहचाने गए न्यूरॉन्स और दूध पिलाने के व्यवहार से कैल्शियम सिग्नल के युगपत रिकॉर्डिंग ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

Summary

फल मक्खी,<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> खिलाने के लिए अपनी सूंड फैली, अपनी सूंड या टैसास से एक चीनी प्रोत्साहन के लिए जवाब है. मैं एक कैल्शियम इमेजिंग तकनीक के साथ सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रतिशत) की टिप्पणियों संयुक्त है, हमारे दिमाग में न्यूरॉन्स की गतिविधियों पर नजर रखने के लिए, व्यवहार अवलोकन के साथ एक साथ अनुमति देता है.

Abstract

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP¹, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons^2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding⁶ (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER⁷ with a calcium imaging technique⁸ using GCaMP3.0^{1, 9}, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center – the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus (“Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage”: “FLIES”) to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca²⁺ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Protocol

1. मक्खियों का निर्माण करना 35 मिमी फाल्कन डिश के ढक्कन से sidewall के पिघलने और यह नक्काशी के लिए एक उपयुक्त कोण और मोटाई (चित्रा 2 चित्रा 1a) के रूप में एक मंच आकार. मक्खी (चित्रा 1 क, ख) सिर, जैसे कि mouthparts आज़ादी कक्ष के बाहर (चित्र 1a) को उजागर कर रहे हैं स्वीकार करने के लिए मंच में एक छेद ड्रिल. एक Pipetman टिप के अंत के आकार उड़ मनाया जा करने के लिए मिलान के साथ, कट. गोंद मंच करने के लिए टिप के रूप में चित्र 1a में दिखाया (चित्रा 2) मक्खियों को पूरा करने के लिए. 2. अवलोकन के लिए फ्लाई तैयारी 25 में 24 घंटे के लिए एक वयस्क मक्खी भूखे रहना डिग्री सेल्सियस यह एक शीशी में केवल एक गीला कागज तौलिया के साथ रखने अगर भुखमरी आवश्यक है के द्वारा प्रयोग करने के लिए पूर्व. मक्खी यह 15ml प्लास्टिक ट्यूब में बर्फ पर खड़ा रखकर असंवेदनता उत्पन्न करना. संदंश का प्रयोग, के कक्ष में एक मक्खी सम्मिलितमक्खियों, और धीरे से धक्का में मक्खी जब तक यह करने के लिए स्थानांतरित करने में असमर्थ है. फिर, एक मक्खी बनाए रखने प्लग डालें. (चित्रा 1 क, ख). छेद की अंदरूनी किनारे के समीपस्थ सूंड (व्याख्यान चबूतरा) के आसपास के भागों सील, पक्षों को प्रकाश इलाज गोंद (Tetric EvoFlow) की एक छोटी राशि लागू करें और व्याख्यान चबूतरा ऊपर से बाहर (चित्रा 3 में तीर). इसके अलावा मक्खियों के अंदर से पृष्ठीय भाग और सिर के छेद की अंदरूनी किनारे (चित्रा 1b) के बीच अंतरिक्ष के लिए गोंद लागू होते हैं. मंचिका आज़ादी से स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देते हैं, देखभाल के लिए एक बरौनी (या तुलनीय कुछ) का उपयोग करने के लिए गोंद फैल द्वारा व्याख्यान चबूतरा छूने से किसी भी गोंद को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए. अंत में, नीले अत्यधिक गर्मी से मक्खी हानिकारक से बचने के इलाज के लिए पर्याप्त प्रकाश की कमजोर रोशनी के साथ गोंद का इलाज. प्लग निकालें. एक व्याख्यान चबूतरा आंशिक रूप से उठाया (3 चित्र में तीर) पकड़ धागा मक्खी को स्थिर करने के लिए नियोजित किया जा सकता है 'एसओजी के ग्रसनी भाग की टक्कर से बचने और एसओजी के उदर भाग को उजागर करने के लिए,, इमेजिंग Gr5a 8 न्यूरॉन्स, जो ग्रसनी जब सूंड पूरी तरह से मुकर गया है के भाग के द्वारा कवर किया जाता presynaptic टर्मिनलों के लिए विशेष रूप से सिर. KCl, 2; 2 MgCl, 4.5, 2 CaCl, 1.5, और HEPES NaOH 10 7.1 का एक pH के साथ 5, NaCl 140: एक चीनी मुक्त खारा (मिमी) युक्त के साथ मंच की सतह भरें. यह sucrose के मुक्त खारा आमतौर पर इस्तेमाल किया उन सूक्रोज युक्त ऐसे 11 HL3.1 के रूप में Salines के लिए इसी तरह की सुर, शक्तिप्रदता है. सिर कैंची, जो एक कस्टम युक्ति है और मूल रूप से डा. Kageyuki Yamaoka, जापान, द्वारा डिजाइन छल्ली और ट्रेकिआ क्लिप एसओजी (चित्रा 4) बेनकाब की तरह तेज सुझावों के साथ एक टंगस्टन ब्लेड और संदंश का उपयोग कैप्सूल खोलें. सिर छल्ली के उदर किनारे उदर के रूप में संभव के रूप में काट दिया गया जबकि पृष्ठीय धार में कटौती के रूप में महत्वपूर्ण नहीं था. सबसे पहले, के माध्यम से एक चीरा बनाने केपीछे बढ़त टंगस्टन ब्लेड का उपयोग कर. तो, पक्ष के माध्यम से कटौती और पूर्वकाल तेज संदंश का उपयोग किनारों. कट छल्ली टुकड़ा संदंश के साथ हटा लिया जाना चाहिए और हटाया. एंटीना और antennal नसों तेज संदंश द्वारा कटौती करनी चाहिए. क्रम में रिकॉर्डिंग के दौरान आंदोलन कलाकृतियों से बचने के लिए, मक्खी के कुछ भागों को हटाने के मस्तिष्क के माध्यम से स्थिर हो जाना चाहिए. सबसे पहले, चुनिंदा एसओजी और उपत्वचा के बीच हवा बोरियों को हटा दें. ग्रसनी की ओर अंत में घुटकी और एसओजी में जाने के लिए ग्रसनी और मस्तिष्क के बीच कनेक्शन को हटाने के अंत में कटौती. फिर बाहर 16 12 स्नायु खींच है, और अंत में, किसी भी मस्तिष्क और छल्ली जोड़ने के ट्रेकिआ से अलग है. हम एक ओलिंप BX51WI कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी प्रणाली (में Improvision PerkinElmer) (चित्रा 5) से जुड़े खुर्दबीन के मंच पर हमारे मक्खियों सेट. पानी विसर्जन लेंस, जैसे 40X/0.8 एनए, स्नान (चित्रा 6 में डूब गया था </strong>). 3. 2 मस्तिष्क के इमेजिंग + Ca Ca 2 + इमेजिंग GCaMP3.0 का उपयोग 1, 9 Marella एट अल द्वारा स्थापित विधि के माध्यम से किया गया था. 8 (चित्रा 6). एक कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी (Improvision) का प्रयोग, 4Hz पर 122ms के एक जोखिम समय है 491nm उत्तेजना लेजर का उपयोग के साथ एक ऑप्टिकल अनुभाग ले, ब्याज (एक मोटर न्यूरॉन के एक सेल शरीर है, या एक interneuron, या presynaptic टर्मिनलों के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित स्वाद संवेदी न्यूरॉन्स के साथ वेग सॉफ्टवेयर, देखें). 4.3 (Improvision). 4. सूंड उत्तेजक एक छोटे से (जापानी washi कागज से बने, विशिष्ट अभिकर्मकों की टेबल देखें) बाती टिप (चित्रा 7) से उभड़नेवाला के साथ एक चमड़े के नीचे सुई में 100mm जलीय sucrose के समाधान महाप्राण (व्यंजन). बाती पर sucrose के समाधान की एक छोटी सी बूंद निर्वहन, तो, यह महाप्राण (व्यंजन), तुरंत beforई सूंड की टिप करने के लिए भिगो washi कागज बाती को लागू करने. Washi कागज बाती केवल एक तुष्टि (चित्रा 8) से बचने के पल के लिए लागू किया जाना चाहिए. सूंड एक्सटेंशन (प्रतिशत) रिस्पांस व्यवहार का उपयोग करते हुए एक सीसीडी कैमरा एक विच्छेदन खुर्दबीन के लिए संलग्न (चित्रा 5) 2 + CA इमेजिंग के साथ एक साथ मॉनिटर. डेटा क्योंकि प्रतिशत प्रतिक्रिया इन परिस्थितियों में एक घंटे से अधिक नहीं रखा है विच्छेदन शुरू करने के बाद एक घंटे के भीतर लिया जाना चाहिए. 5. प्रतिनिधि परिणाम व्याख्यान चबूतरा कोणमापक, प्रमुख सूंड विस्तार के लिए व्याख्यान चबूतरा उठाने के लिए जिम्मेदार मांसपेशियों की एक जोड़ी, मोटर न्यूरॉन्स के लिए मिठाई 13 stimuli करने के लिए मजबूत प्रतिक्रियाओं को दिखाने के लिए सूचित किया गया है 9 शो चित्रा 2 Ca संकेत + 1 GCaMP3.0, 9 के माध्यम से एक के द्वारा व्यक्त की लड़की 4 ड्राइवर, मोटर न्यूरॉन के एक सेल शरीर से 13 E49,. वीडियो एक robu में दिखायासेंट के अनुसार प्रति synchrony में 2 + संकेत Ca में वृद्धि के साथ मनाया गया. आकृति 1. फ्लाई मस्तिष्क लाइव इमेजिंग और इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी स्टेज (मक्खियों) के योजनाबद्ध. , मक्खियों ऐसा है कि दीवार के कोण की अनुमति देता है के लिए उड़ सिर बाहर आने के लिए सीधे बनाया गया है. मक्खी सूंड के तीन खंडों रंग कोडित रहे हैं, व्याख्यान चबूतरा मैजंटा है. मक्खी संदंश के साथ कक्ष में डाला जाता है, और ख एक एक Pipetman टिप के अंत से टुकड़ा काट कक्ष के पीछे भागने से मक्खी ब्लॉक में plugged है., छेद है मक्खी के सिर के अनुरूप ऊब जाता है. शेष अंतराल प्रकाश इलाज के गोंद के साथ सील कर रहे हैं के रूप में करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई लीक कर रहे हैं संकेत दिया है. गोंद के बाद ठीक है, एक प्लग के रूप में Pipetman टिप निकाल दिया जाता है. खारा ऐसी है कि मस्तिष्क की सतह पूरी तरह से कवर किया जाता है मक्खियों में डाल दिया है. यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि वहाँ कोई खारा रिसाव हैमक्खी सिर के पूर्वकाल अंत पर बाहर हैं. छायांकित पैनल ख में धराशायी लाइन से घिरे क्षेत्र बाहर विच्छेदित भाग से पता चलता है. चित्रा 2. मक्खियों की तस्वीर गोंद का वर्धमान आकार दीवार (एक गोंद बंदूक से) छिड़काव के दौरान नमकीन घोल के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए, और खारा की राशि इस्तेमाल कम किया जाता है. चित्रा 3. एक मक्खी के ललाट दृश्य मक्खियों में घुड़सवार इस छवि से पता चलता है कि कैसे एक मक्खी मक्खियों में सेट कर दिया जाता है, और कैसे इलाज गोंद प्रकाश के (तीर) मक्खी के लिए एक नमक सबूत मुहर बनाने के सिर के चारों ओर लागू किया जाता है. अगर मक्खी की सूंड के माध्यम से किसी भी खारा लीक, तो प्रयोग असफल हो जायेगी. धागा (तीर) चरण के लिए सीमित स्थिति में सूंड की पकड़ है, ताकि यह पूरी तरह retrac नहीं है टेड. अन्यथा यह एसओजी के उदर भाग में बाधा डालती है और आंदोलन कलाकृतियों का कारण होगा. चित्रा 4. एक विच्छेदित मक्खी के साथ मक्खियों के ऊपर देखें. इस छवि के लिए एक मक्खी निम्नलिखित छल्ली हटाने के संपर्क में एसओजी को दर्शाता है. घुटकी, 16 स्नायु और tracheae मस्तिष्क से जुड़ा है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चयनित – हवा बोरियों भी उन्हें मस्तिष्क है, जो कैल्शियम संकेतों में कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं परेशान करने से रोकने के हटा दिया गया है. चित्रा 5. निगरानी उपकरण यह उपकरण एक ओलिंप BX51WI एक कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी प्रणाली (Improvision) से जुड़ी खुर्दबीन से इकट्ठा किया है, और एक Nikon SMZ800 खुर्दबीन पक्ष घुड़सवार. इस सेटअप व्यवहार प्रतिशत दौरान मस्तिष्क गतिविधि के रहते इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. 6 "src =" / "files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg /> 6 चित्रा. मक्खियों के पक्ष दृश्य दिखाने के फोटो. खारा समाधान की पतली परत 40X लेंस पानी विसर्जन और मक्खी के बीच sandwiched है. 7 चित्रा. Washi पेपर बाती बनाने के लिए योजनाबद्ध कागज Gampi – washi. एक परंपरागत जापानी चर्मपत्र है कि बहुत पतली और चिकनी (Haibara, जापान) है. यह भी बहुत मजबूत है और तरल पदार्थ की एक बड़ी राशि को बनाए रखने कर सकते हैं. Washi कागज बहुत विशिष्ट आयामों के साथ एक trapezoid में कटौती किया जाना चाहिए, 0.3 मिमी और चौड़ाई में 0.7 मिमी, और लंबाई में 4-5 मिमी (क). यह trapezoid तो एक 23 जी चमड़े के नीचे सुई की नोक में 0.7 मिमी की ओर से डाला है और यह भी एक कीट पिन, जो एक आकार वी (ख) के लिए तुली हुई है की प्रविष्टि के माध्यम से स्थिर किया जा सकता है ग., Washi कागज बन जाता है पारदर्शी निम्नलिखित जोखिमएक एक तरल करने के लिए, इस प्रयोग के लिए आदर्श बना रही है. संख्या 8. Washi – बाती के साथ मक्खियों पर सूंड की उत्तेजना. Washi कागज बाती एक चमड़े के नीचे सुई की नोक पर एक पल के लिए एक हाथ से एक जोस्टिक जोड़तोड़ का उपयोग कर लागू किया जाता है. सुई एक लचीला ट्यूब के माध्यम से एक दूसरे हाथ से चालाकी से सुई लगानेवाला से जुड़ा है aspirating और sucrose के समाधान के निर्वहन के लिए. 9 चित्रा. प्रतिनिधि परिणाम. व्यवहार प्रतिशत stereomicroscope पर स्थापित सीसीडी कैमरा के माध्यम से दर्ज की गई. उत्तेजना से पहले एक विस्तारित (तीर) सूंड, उत्तेजना में, के साथ और एक 100 मिमी sucrose के जलीय घोल (नोक) युक्त बाती के साथ उत्तेजना के बाद एक भूखे मक्खी के ललाट देखा गया. रोशनी एक 491 एनएम इस्तेमाल किया लेजर द्वारा पूरा किया हैGCaMP प्रतिदीप्ति ख के लिए, GCaMP भूखे राज्य में मंचिका मांसपेशी की कोणमापक के लिए मोटर न्यूरॉन में 3.0 प्रतिक्रिया Sucrose प्रेरित. शीर्ष पैनल उत्तेजना से पहले, वह नीचे के पैनल उत्तेजना के तुरंत बाद. पैमाने पर पट्टी, 10 माइक्रोन ग., Sucrose के प्रेरित GCaMP 3.0 प्रतिक्रिया की मात्रा. मोटर न्यूरॉन प्रतिदीप्ति में तेजी से वृद्धि बेस लाइन के लिए कई सेकंड के एक बहाली चरण के बाद से एक sucrose के प्रोत्साहन के लिए जवाब है.

Discussion

मक्खियों सीए ^{2 +} संकेतों और प्रतिशत व्यवहार के युगपत रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है. भी खारा सामान्य प्रतिशत व्यवहार को उजागर मस्तिष्क के साथ मनाया गया. बाती Gampi – washi एक Kimwipe मूल केश method7 में इस्तेमाल किया बाती के बजाय का उपयोग एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और स्थिर प्रतिशत व्यवहार की सुविधा और बनाने और अच्छा Kimwipe बाती को चुनने में कुशल हो की आवश्यकता टाल. प्रयोगात्मक सुझावों ऊपर कहा गया है हमें सफलतापूर्वक सूंड का आंदोलन द्वारा गड़बड़ी से बचने, ² CA के एक बहुत ही स्थिर रिकॉर्डिंग करने के लिए अग्रणी ⁺ कम शोर के साथ संकेतों की अनुमति दी. कभी कभी, ऊतक को हटाने के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए या आंदोलन को दबाने पर्याप्त रूप से पर्याप्त नहीं था गरीब परिणाम के लिए अग्रणी. हालांकि, एक बार हम कुशल थे, तैयारी के 80% से अधिक अच्छे परिणाम का उत्पादन किया. इस पद्धति ^{2 +} CA इमेजिंग के लिए ही नहीं है, लेकिन यह भी किसी भी रहते इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जबकि व्यवहार प्रतिशत देख. उदाहरण के लिए, हम के माध्यम से किसी भी सेल का उपयोग कर सकते हैंएक इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए सीधे गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए. दो photon उत्तेजना माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त है, हम के synaptic संरचना के समय चूक इमेजिंग, जो व्यवहार में बदलाव के लिए संबंधित हो सकता है प्रदर्शन कर रहे हैं. इसलिए, मस्तिष्क इमेजिंग के व्यवहार अवलोकन के साथ इस पद्धति न केवल neuronal नेटवर्क के कार्यात्मक विच्छेदन के लिए मूल्यवान है, लेकिन स्मृति के पीछे तंत्र को synaptic plasticity ¹⁴ सहसंबंधी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Materials

Name of Equipment/Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Tetric EvoFlow	Ivoclar vivadent	M04115	Light-curing glue
BX51WI Microscope	Olympus	BX51WI	With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens
Spinning disk confocal microscope system	Improvision in PerkinElmer		With 491 nm laser
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-800	Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording
Gampi-Washi paper	Haibara, Japan		A special kind of traditional Japanese paper
CCD camera	Imaging Source	DFK41AU02	1/2″ 1080 × 960 pixels SONY CCD
Joystick manipulator	Narishige	MN-151
Injector	Narishige	IM-5B