확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

Summary

과일 파리,<em> Drosophila melanogaster</em>의 코 또는 족근에서 설탕 자극에 반응, 먹일의 코를 확장합니다. 난 우리가 행동 관찰과 함께 동시에, 두뇌의 뉴런의 활동을 감시할 수 있도록 칼슘 이미징 기술을 코 확장 반응 (당)의 관찰을 결합했습니다.

Abstract

행동에서의 기능의 측면에서 네트워크의 연결을 공부하기 위해, 우리는 각각의 행동 패턴이 생성되면 뉴런이 작동 방법을 분석한다. 따라서,의 연결 활동 및 행동의 동시 녹음 행동 두뇌 활동을 연관시키는 것은 필수적입니다. 그러한 행동 분석은 과일 파리, Drosophila melanogaster, 우리 같은 GCaMP ¹ 등 유전자 인코딩 칼슘 지표를 통합할의 연결 활동을 모니터링하고, 특히 뉴런 ^2-5 확인된 활성화 optogenetic 또는 thermogenetic 기법에 대한 정교한 유전자 조작을 사용할 수 있습니다. thermogenetic 기법의 사용은 먹이 행동에 중요한 뉴런 (홍수 외., 개정 이하)을 찾기 위해 우리를 이끌었습니다. 의 코 또는 tarsi의 감각 세포에서 달콤한 자극에 반응; 동작을 먹이의 주요 부분으로 Drosophila 성인 ⁶ (사람마다 코 확장 응답)를 먹일 때 그 코를 확장합니다. 공동행동 관찰과 동시에, suboesophageal 신경절 (SOG) – GCaMP3.0 ^1을 사용 칼슘 이미징 기법 ^{8, 9와 7} 작자에 대한 프로토콜을 mbining, 난 우리가 먹이 센터에서 뉴런의 활동을 모니터할 수있는 실험적인 시스템을 설립 코니다. 뇌의가 물 침지 렌즈를 통해 ⁺ 이미징 칼슘 ² 목욕에 노출되는 동안의 코 자유롭게 이동할 수 있도록 Drosophila 성인을 수용할 수 있도록 : 나는 장치를 ( "파리" "플라이 두뇌 라이브 이미징 및 전기 생리학 스테이지") 설계했습니다 . 파리 또한 electrophysiological 녹음이나 시냅스 형태의 저속 이미징과 같은 플라이 두뇌에 게재 실험의 여러 유형에 적합합니다. 라이브 이미징의 결과가 직접적으로 동시 인당 동작과 상호 수 있으므로,이 방법론의 연결 네트워크의 정보 처리를 공부하기위한 좋은 실험적인 시스템을 제공하고, 어떻게 사용자 수ellular 활동은 플라스틱 프로세스 및 메모리에 결합됩니다.

Protocol

1. 파리를 구축 측벽에 녹아하고 적절한 각도와 두께 (; 그림 2 그림 1A)을 형성하기 위하여 그것을 조각하여 35mm 팔콘 요리의 뚜껑에서 플랫폼을 형성. mouthparts 자유롭게 챔버 (그림 1A)의 외부에 노출되는 등 파리 헤드 (그림 1A, B)를 수용하는 플랫폼에 구멍을 드릴 다운합니다. 파리가 관찰되는 매칭 크기, Pipetman 팁의 끝을 잘라요. 플랫폼에 접착제는 팁 파리 (그림 2)를 완료하기 위해 그림 1A와 같이. 2. 관측을위한 플라이 준비하기 25 24 시간 동안 성인 파리를 굶어 ° C에서 기아가 필요한 경우에만 젖은 종이 타월과 함께 유리병에 넣어 의해 실험 이전. 빙판에 서있는 15ml 플라스틱 튜브에 배치하여 파리를 마취. 포셉 사용의 챔버로 플라이를 삽입파리, 그리고 움직이지 못할 때까지 가볍게에서 파리를 밀어. 그런 파리를 유지하기 위해 플러그를 삽입합니다. (그림 1A, B). 구멍의 안쪽 가장자리에 근위 코 (연단)의 주변 부분을 밀봉, 양쪽에 가벼운 경화 접착제 (Tetric EvoFlow)의 소량을 적용하고부터 연단 위에 밖으로 (그림 3의 화살표). 파리의 안쪽에서 머리 지느러미 부분과 구멍의 내부 모서리 (그림 1B) 사이의 공간에 접착제도를 적용합니다. 연단 자유롭게 이동할 수 있도록하려면주의가 접착제를 확산 속눈썹 (또는 비교 무언가)을 사용하여 연단을 만져서 어떤 접착제를 방지하기 위해 이동해야합니다. 마지막으로, 과도한 열에서 파리 손상을 방지하기 위해 치료를위한 충분한 푸른 빛의 약한 조명과 접착제를 치료. 플러그를 제거합니다. 연단 부분 (그림 3의 화살표) 해제를 개최하는 스레드 플라이를 안정시켜 고용 수 있습니다 'SOG로 pharyngeal 부품의 충돌을 피하고, 특히 코가 완전히 철회되는 인두의 일부로 적용되는 Gr5a 뉴런 8의 영상 presynaptic 터미널에 대해, SOG의 복부 부분을 노출하여 s의 헤드. , KCl, 2, MgCl 2, 4.5, CaCl 2, 1.5, 그리고 HEPES-NaOH, 5 7.1 10 산도와 NaCl, 140 : 무설탕 염분 함유 (㎜)을 함께 플랫폼의 표면을 채우십시오. 이 자당없는 염분은 일반적으로 사용되는 분들 자당 함유 같은 HL3.1 11로 salines을과 비슷한 tonicity 있습니다. 맞춤 장치이며 원래 SOG를 (그림 4) 노출 표피와 호흡 관을 버리 박사 Kageyuki 야마오카, 일본, 설계한 가위처럼 날카롭게 조언과 텅스텐 칼날과 집게를 사용하여 헤드 캡슐을 엽니다. 지느러미 가장자리 상처 등 중요한 아니었 반면 머리 표피의 복부 가장자리는 가능한 한 복부으로 절단되었다. 첫째,을 통해 절개를 할후부 가장자리 텅스텐 블레이드를 사용. 그런 측면을 잘라 날카롭게 집게를 사용하여 앞부분은 가장자리. 컷 표피 조각은 집게와 함께 해제 및 제거해야합니다. 안테나 및 antennal 신경이 날카롭게 포셉 의해 절단해야합니다. 녹음하는 동안 움직임 유물을 피하기 위해, 머리가 파리의 특정 부분의 제거를 통해 안정되어야합니다. 첫째, 선택적으로 SOG와 표피 사이에 공기 자루를 제거합니다. 인두쪽으로 끝에 및 인두와 뇌 사이의 연결을 제거하는 SOG로가는 끝에 식도를 잘라. 그렇다면 근육 16 12를 꺼내, 그리고 마지막으로, 두뇌와 표피를 연결하는 기관을 분리. 우리는 스피닝 디스크 공촛점 현미경 시스템 (PerkinElmer에서 Improvision) (그림 5)에 연결된 올림푸스 BX51WI 현미경의 무대에서 우리의 파리를 설정합니다. 물 침지 렌즈, 예를 들어 40X/0.8 NA는 목욕탕 (그림 6에 열중했다 </strong>). 3. 칼슘이 뇌 + 이미징 칼슘 2 + 영상은 GCaMP3.0를 사용하여 1, 9가 Marella 외가 정한 방법을 통해 수행되었다. 8 (그림 6). 스피닝 디스크 공촛점 현미경 (Improvision) 사용하면, 관심있는 지역 (모터 신경 세포의 세포 본문, interneuron, 또는 presynaptic 터미널에 초점을 맞추고, 491nm 여기 레이저를 사용하여 122ms의 노출 시간과 4Hz에서 하나의 광학 부분을 받아 gustatory 감각 뉴런의) 속도 소프트웨어 버전과. 4.3 (Improvision). 4. 코을 자극 팁 (그림 7)에서 튀어나온 작은 심지 (일본어 Washi 종이로 만든, 특정 시약의 표 참조)로 피하 주사 바늘로 100mM 수성 자당 솔루션을 기음. 심지쪽으로 자당 솔루션의 작은 방울 방전 후 즉시 befor, 그것을 기음코 끝에 젖은 Washi 종이 심지를 적용 5. Washi 종이 심지는 포만 (그림 8)을 피하기 위해 즉각 신청해야합니다. 코 확장 응답 (당) 칼슘 2 + 이미징와 동시에 (그림 5) 해부 현미경에 부착된 CCD 카메라를 사용하여 동작을 모니터링합니다. 데이터 인당 응답이 이러한 조건 하에서 하나 이상의 시간 유지되지 않기 때문에 절개를 시작 후 한 시간 이내 촬영해야합니다. 5. 대표 결과 연단의 분도기, 코 확장을위한 연단을 리프팅을 담당 주요 근육의 쌍의 모터 뉴런은 달콤한 자극 13 강력한 반응을 보여주보고되었습니다. 그림 9 보여주는 칼슘 2 + 신호 GCaMP3.0 1, 9까지로 표현 모터 신경 세포의 세포 시체에서 걸 네 드라이버, E49 13. 비디오, robu에 표시된 바와 같이일 인당는 칼슘 2 + 신호의 증가 synchrony에서 관찰되었다. 1 그림. 플라이 두뇌 라이브 이미징 및 전기 생리학 무대 (파리)의 개략도. , 파리는 파리 머리는 똑바로 나오게하는 벽의 각도가 허용되는 등 내장되어 있습니다. 플라이 코 세 세그먼트는 색깔, 연단은 자홍색이다. 파리는 집게와 챔버에 삽입하고, Pipetman 팁의 끝 부분부터 잘라 조각 탈출 플라이를 차단하는 챔버의 뒷면에 연결합니다. B는, 구멍은 파리의 머리에 부합하는 지루합니다. 전혀 누수가없는 것을 확인하기 위해 지적대로 남아있는 격차는 광 경화 접착제로 봉인된다. 접착제가 완치되면 플러그 같은 Pipetman 팁이 제거됩니다. 식염수는 두뇌의 표면이 완전히 덮여있는 등 파리에 부어있다. 그것은 아무 식염수 누수가 없다는 것을 보장해야파리 머리의 앞부분 끝에 밖으로 접근한. 패널 B의 점선으로 둘러싸인 음영처리된 영역 밖으로 해부되는 부분을 보여줍니다. 그림 2. 파리 사진. 접착제의 초승달 모양의 벽이 (아교 총에서) 재관류 동안 생리 식염수의 흐름을 제어하고, 사용되는 염분의 양을 줄이기 위해 만들어졌다. 그림 3. 파리의 정면보기 광 경화 접착제는 염분 방지 도장을 만들 플라이 (화살표)의 머리 주위에 적용되는 방법이 이미지는 파리가 파리에서 설정하는 방법을 보여줍니다. 파리에 마운트합니다. 파리의 코에 이르기까지 모든 식염수 누수 다음, 실험이 실패합니다 바랍니다. 무대 곁에 스레드 (화살촉) 완전히 retrac되지 않도록 위치 코를 개최하는 것입니다 테드. 그렇지 않으면 그것은 SOG의 더 많은 복부 부분을 방해하고 운동 아티팩트를 일으킬 것이다. 4 그림. 해부 플라이와 함께 파리 최고의 전망.이 이미지는 파리 다음과 표피 제거의 노출된 SOG를 보여줍니다. 식도, 근육 16 tracheae는 두뇌에 연결뿐만 아니라, 선택된 공기 자루는 또한 칼슘 신호의 유물로 이어질 수있는 두뇌를 방해 못하도록 방지하기 위해 제거되었습니다. 그림 5. 감시 장치가.이 장치는 회전 디스크 공촛점 현미경 시스템 (Improvision)에 연결된 올림푸스 BX51WI 현미경에서 조립, 그리고 니콘 SMZ800 현미경 측면 – 마운트됩니다. 이 설정은 동작 인당 동안 뇌 활동의 라이브 영상을 허용합니다. 6 "SRC ="/ files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/> 6 그림. 파리의 측면 뷰를 게재할 사진은. 생리 식염수의 얇은 계층은 40X 물에 침지 렌즈와 플라이 사이에 끼워 넣었지있다. 그림 7. Washi 종이 심지를 만들기위한 설계도. Gampi – Washi 종이는 (Haibara, 일본) 매우 얇고 매끄러운입니다 일본 전통 양피입니다. 그것은 또한 매우 강한 액체의 다량을 유지하실 수 있습니다. Washi 용지는 매우 구체적인 치수와 사다리꼴로 절단되어야하며 0.3 mm 및 0.7 mm 폭 및 길이 4-5밀리미터합니다 (). 이 사다리꼴 그때 23 G의 피하 바늘 끝으로 0.7 밀리미터 측면에서 삽입하며 V 자형 (B)에 굽습니다 곤충 핀의 삽입을 통해 안정 수 있습니다. C가, Washi 종이가된다 투명 다음 노출액체로,이 실험에 이상적입니다. 그림 8. Washi-심지가있는 파리에 코의 자극은. 피하 주사 바늘의 일각에 Washi 종이 심지는 한 손으로 조이스틱 조작하는 사람을 사용하여 인스턴트에 대해 적용됩니다. 바늘은 자당 솔루션을 aspirating 및 배출을 위해, 다른 한편으로 조작 주입기에 유연한 튜브를 통하여 연결되어 있습니다. 9 그림. 대표 결과입니다. 는 행위 당 stereomicroscope에 설치된 CCD 카메라를 통해 기록했습니다. 자극에 자극을하기 전에 확장 코 (화살표)와 100 밀리미터 자당의 수성 솔루션 (화살촉)를 포함하는 심지와 자극 후 굶주린 파리의 정면 전망이 있습니다. 조명이 사용 491 nm의 레이저에 의해 수행됩니다GCaMP 형광. B를 위해, 굶주린 상태에서 연단 근육의 분도기를위한 모터 신경 세포의 GCaMP 3.0 응답 자당 유발. 자극 전에 상단 패널, 하단 패널, 즉시 자극 후. 스케일 바, 10 μm의. C, 자당 유발 GCaMP 3.0 응답의 부량. 모터 뉴런은베이스 라인에 몇 초 정도의 복원 단계 다음에 형광의 급격한 증가에 의해 자당의 자극에 응답합니다.

Discussion

파리 칼슘 ^{2 +} 신호와 PER 행동의 동시 녹음을 허용합니다. 비록 함께 식염수 정상 인당 행동에 노출되어 머리가 관찰되었다. 대신 원래 모세관 method7에서 사용 Kimwipe의 심지의 Gampi-Washi의 심지를 사용하여 높은 재현성과 안정 인당 행동을 용이하게하고 만들고 좋은 Kimwipe의 심지를 선택하는데 숙련된 될 필요성을 방지합니다. 실험 조언은 우리가 성공적으로 칼슘 ^2의 매우 안정적인 녹음으로 이어지는, 코의 움직임에 의해 교란을 피하기 위해 ⁺ 신호를 저소음으로 사용할 위에서 언급한. 때로는 조직 제거 가난한 결과로 이어지는, 세포를 노출하거나 적절하게 운동을 억제하기에 충분 아니었어요. 그러나 일단 우리가 숙련된 있었 준비를 80 % 이상 좋은 결과를 생산했다. 이 방법론은 칼슘 ^{2 +} 이미징을위한뿐만 아니라하지만, 행동에 따라 관찰하면서 또한 실시간 영상으로 적응 수 있습니다. 예를 들어, 우리를 통해 세포에 액세스할 수 있습니다직접 활동을 기록하는 전극을 사용하지 않습니다. 두 광자 여기 현미경과 결합하여, 우리의 행동 변화에 관한 수 시냅스 구조의 저속 이미징을 수행할 수 있습니다. 따라서, 행동 관찰을 통한 두뇌 이미징이 방법의 연결 네트워크의 기능적 해부에 대한 가치뿐만 아니라,하지만 메모리의 배후 메커니즘에 시냅스 소성의 ¹⁴ 연관시키는 강력한 도구로 사용될 수 있습니다.

Materials

Name of Equipment/Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Tetric EvoFlow	Ivoclar vivadent	M04115	Light-curing glue
BX51WI Microscope	Olympus	BX51WI	With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens
Spinning disk confocal microscope system	Improvision in PerkinElmer		With 491 nm laser
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-800	Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording
Gampi-Washi paper	Haibara, Japan		A special kind of traditional Japanese paper
CCD camera	Imaging Source	DFK41AU02	1/2″ 1080 × 960 pixels SONY CCD
Joystick manipulator	Narishige	MN-151
Injector	Narishige	IM-5B