Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus
Summary
Hier beschreiben wir die erste Good Manufacturing Practice (GMP)-kompatiblen Verfahren zur Herstellung virus-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) aus Nabelschnurblut, eine Quelle von überwiegend naiven T-Zellen.
Abstract
Virus-Infektionen nach einer Stammzelltransplantation gehören zu den häufigsten Todesursachen, besonders nach Nabelschnurblut (CB) Transplantation (CBT), wo die CB enthält keine nennenswerte Zahl von Virus-erfahrenen T-Zellen, die den Empfänger vor einer Infektion schützen können 1. – Wir und andere 4 gezeigt, dass Virus-spezifische CTL von seropositiven Spendern erzeugt und an den Empfänger infundiert haben sind sicher und schützend. 5-8 jedoch bis vor kurzem Virus-spezifischen T-Zellen nicht aus Nabelschnurblut erzeugt werden, was wahrscheinlich auf die Abwesenheit von virus-spezifischen Gedächtnis-T-Zellen.
In dem Bemühen, besser zu imitieren die in vivo Bedingungen Priming von naiven T-Zellen haben wir ein Verfahren, CB-abgeleitete dendritische Zellen (DC) transduziert mit einem adenoviralen Vektor (Ad5f35pp65), enthaltend die CMV immundominanten pp65 verwendet, daher T-Zell-Spezifität Antreiben Richtung CMV und Adenovirus. 9 Bei der Initiierung, verwenden wir diese marierte DCs sowie CB-abgeleiteten T-Zellen in Gegenwart der Cytokine IL-7, IL-12 und IL-15. 10 In der zweiten Stimulation verwendeten wir EBV-transformierten B-Zellen oder EBV-LCL, die sowohl exprimieren latente und lytische EBV-Antigene. Ad5f35pp65-transduzierten EBV-LCL werden verwendet, um die T-Zellen in Gegenwart von IL-15 bei der zweiten Stimulation zu stimulieren. Nachfolgende Reize verwenden Ad5f35pp65-transduzierten EBV-LCL und IL-2.
Von 50×10 6 CB mononukleären Zellen können wir nach oben von 150 x 10 6 Virus-spezifischen T-Zellen, Antigen-gepulste Freisetzung Targets und Zytokinen in Reaktion auf Antigenstimulation lysieren erzeugen. 11. Diese Zellen wurden in einer GMP-gerechte Weise hergestellt unter Verwendung nur die 20%-Anteil an einer fraktionierten Nabelschnurblut Einheit und haben für den klinischen Einsatz übersetzt worden.
Protocol
Discussion
Aktuelle Strategien zur Steuerung virale Infektionen nach CBT soll wirksam sein kann, aber sie sind mit erheblicher Toxizität verbunden sind, sind teuer und nicht verleihen langfristigen Schutz gegen spätere Infektionen. In der Tat kann die Verwendung einiger antiviralen Medikamenten begrenzen die Expansion des Virus-spezifischen T-Zellen, die sonst Schutzschicht. 14 weitere Option ist die Infusion von Donor-derived Virus-spezifischen T-Zellen. Wir und andere haben gezeigt, dass solche T-Zellen sicher…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Dan L. Duncan kollaborative Forschungsstipendium (CMB und EJS), der National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), ein Leukemia and Lymphoma Society Clinical Research Scholar Award (CMB), und dem National Cancer Institute unterstützt (RO1 CA06150816; EJS).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson-Wolf | 80040S |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | |
| IL-12 | NCI/CTEP | |
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 |
| IL-7 | R&D | AFL207 |
| IL-1beta | R&D | AFL201 |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | |
| IL-4 | R&D | AFL204 |
| TNF-alpha | R&D | AFL210 |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | |
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
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