Expanderande Cytotoxiska T-lymfocyter från navelsträngsblod att Target cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, och adenovirus
Summary
Här beskriver vi den första god tillverkningssed (GMP)-kompatibel metod för framställning av virus-specifika cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) från navelsträngsblod, en källa till övervägande naiva T-celler.
Abstract
Virusinfektioner efter stamcellstransplantation är bland de vanligaste dödsorsakerna, särskilt efter navelsträngsblod (CB) transplantation (KBT) där CB inte innehåller väsentliga mängder virus-erfarna T-celler som kan skydda mottagaren från smitta 1. – 4 Vi och andra har visat att virus-specifika CTL genereras från seropositiva donatorer och infunderas till mottagaren är säkra och skyddande. 5-8 Men tills nyligen kunde virus-specifika T-celler inte genereras från navelsträngsblod, troligen på grund av den avsaknad av virus-specifika celler minnes-T.
I ett försök att bättre efterlikna in vivo priming förhållanden naiva T-celler har vi etablerat en metod som används CB-härledda dendritiska celler (DC) omvandlade med en adenovirusvektor (Ad5f35pp65) som innehåller den immunodominanta CMV-antigen pp65, därför driver T-cell specificitet mot CMV och adenovirus. 9 Vid initiering, använder vi dessa mastrukturerade DC liksom CB-härledda T-celler i närvaro av cytokinema IL-7, IL-12 och IL-15. 10 Vid den andra stimuleringsfas vi använt EBV-transformerade B-celler, eller EBV-LCL, som uttrycker både latenta och lytiska EBV-antigener. Ad5f35pp65-transducerade EBV-LCL användes för att stimulera T-cellerna i närvaro av IL-15 vid den andra stimuleringen. Efterföljande stimuleringar använder Ad5f35pp65-transducerade EBV-LCL och IL-2.
Från 50×10 6 CB mononukleära celler kan vi generera uppemot 150 x 10 6-virus-specifika T-celler som lyserar antigen-pulsade mål och cytokiner frisättning som svar på antigenstimulering. 11 Dessa celler tillverkades i en GMP-kompatibel sätt med användning endast den 20% fraktion av en fraktionerad navelsträngsblod enhet och har översatts för klinisk användning.
Protocol
Discussion
Nuvarande strategier som syftar till att kontrollera virusinfektioner efter KBT kan vara effektiva, men de är associerade med betydande toxicitet, är dyra och ger inte långsiktigt skydd mot senare infektion. I själva verket kan användningen av vissa antivirala läkemedel begränsa expansionen av virus-specifika T-celler som annars skulle vara skyddande. 14 Ett annat alternativ är infusion av donator-härledda virus-specifika T-celler. Vi och andra har visat att sådana T-celler är säkra, effekti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en Dan L. Duncan samarbete forskningsanslag (CMB och EJS) National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), en leukemi och lymfom Society Clinical Research Scholar utmärkelse (CMB) och National Cancer Institute (RO1 CA06150816, EJS).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson-Wolf | 80040S |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | |
| IL-12 | NCI/CTEP | |
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 |
| IL-7 | R&D | AFL207 |
| IL-1beta | R&D | AFL201 |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | |
| IL-4 | R&D | AFL204 |
| TNF-alpha | R&D | AFL210 |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | |
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
References
- Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
- Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713 (2010).
- Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22 (2010).
- Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
- Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
- Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238 (1992).
- O’Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
- Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
- Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241 (2003).
- Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518 (2011).
- Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958 (1958).
- Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
- Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736 (2011).
- Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588 (2010).
- Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916 (2002).
- Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156 (2008).
- Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S39-S45 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305 (2010).
