אנו מציגים פרוטוקול המאפשר להציג וכמותית לתחת המורפולוגיה של העץ הדנדריטי של תאים בודדים פורקינג' גדלו בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic. פרוטוקול זה נועד לקדם מחקרים על המנגנונים של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג'.
Abstract
תאי פורקינג' הם מערכת מודל אטרקטיבית ללימוד פיתוח הדנדריטים, כי יש להם עץ הדנדריטי מרשים שהוא בהחלט בכיוון במטוס sagittal ומתפתח בעיקר בתקופה שלאחר הלידה במכרסמים קטנים 3. יתר על כן, כמה נוגדנים זמינים אשר באופן סלקטיבי ואינטנסיביים תאי תווית פורקינג' כולל את כל התהליכים, עם D28K אנטי Calbindin להיות בשימוש הנרחב ביותר. לצפייה של הדנדריטים בתאי חיים, עכברים מבטאים EGFP סלקטיבי בתאי פורקינג' 11 זמינים דרך מעבדות ג'קסון. תאי תרבויות פרוסות cerebellar Organotypic לאפשר מניפולציה ניסויית קלה של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג' כי רוב התרחבות הדנדריטים של העץ הדנדריטי תא פורקינג' אכן מתרחש בתקופת התרבות 4. אנו מציגים פרוטוקול קצר, אמין וקל לצפייה וניתוח המורפולוגיה של תאי דנדריטים פורקינג' גדלה בorganotypi כאןג תרבויות פרוסות מוח הקטנים. למטרות רבות, הערכה כמותית של העץ הדנדריטי תא פורקינג' רצויה. נתמקד להלן בשני פרמטרים, גודל עץ הדנדריטי ומספרי נקודות של סניף, שניתן לקבוע במהירות ובקלות מהתרבויות פרוסות אנטי calbindin המוכתמות cerebellar. שני פרמטרים אלו מניבים מדד אמין ורגיש של שינויים של העץ הדנדריטי תא פורקינג'. באמצעות הדוגמא של טיפולים עם החלבון קינאז C (PKC) activator PMA וקולט metabotropic גלוטמט 1 (mGluR1) אנחנו מדגימים כיצד הבדלים בהתפתחות הדנדריטים הם דמיינו וכמותית הוערכה. שילוב של הנוכחות של עץ הדנדריטים נרחב, שיטות immunostaining סלקטיבית ואינטנסיביות, תרבויות פרוסות organotypic שמכסות תקופה של צמיחת הדנדריטים ומודל עכבר עם ביטוי EGFP פורקינג' תא מסוים להפוך תאי פורקינג' מערכת מודל רבת עצמה עבור לחשוף את המנגנונים של הדנדריטים פיתוח.
Protocol
1. הגדרת תרבויות Slice cerebellar Organotypic תרבויות פרוסות cerebellar מוכנים מיום לידה 8 P (8) גורי עכברים בשיטת דגירת סטטי 10. במעבדה שלנו, אנו משתמשים B6CF1 עכברים. בניסויים מסוימים עכברים הטרנסגניים גם שמשו בי להביע EGFP סלקטיבי בתאי פורקינג'. ה?…
Discussion
השיטות שהוצגו כאן מאפשרים ללמוד פיתוח הדנדריטים תא פורקינג' בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic וכדי להעריך כמותית הרחבת הדנדריטים תא פורקינג' על ידי מדידת גודל עץ הדנדריטי ומספר נקודתי הסתעפות הדנדריטים. כמובן, ניתוח כמוני מקיף ומתוחכם יותר של דנדריטים הסלולריים פור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי האוניברסיטה של באזל, המחלקה לביו, והשויצרית הקרן הלאומית למדע (31003A-116624).
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments (optional)
Tissue culture Inserts
Millipore
PICM 03050 PICM ORG50
The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope
Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (61), e3637, doi:10.3791/3637 (2012).