Identifiering av Protein Samverkande Partners Använda Tandem Affinity Purification

Summary

Tandem affinitetsrening är en robust metod för identifiering av proteinbindning partners. Som bevis på konceptet, var denna metod tillämpas på väl karakteriserade translationsinitiering faktor eIF4E till samarbete fälla ut värdcellens faktorer inblandade i translationsinitiering. Denna metod kan lätt anpassas till någon cellulärt eller viralt protein.

Abstract

En kritisk och ofta steget för att förstå funktionen av värd och virala proteiner är identifieringen av interagerande cellulära eller virala proteinpartner. Det finns många metoder som gör det möjligt att identifiera interagerande partner, inklusive jästen två hybridsystemet samt dra ner analyser med hjälp av rekombinanta proteiner och immunoprecipitation av endogena proteiner följt av masspektrometri identifiering ^1. Nyligen genomförda studier har visat nyttan av dubbel-affinitetsmarkör medierad rening, tillsammans med två specifika eluerings steg i identifieringen av interagerande proteiner. Detta tillvägagångssätt, som kallas Tandem Affinity Purification (TAP), användes ursprungligen i jäst ^2,3 men på senare tid har anpassats för användning i däggdjursceller ^4-8.

Som proof-of-concept har vi etablerat en tandem affinitetsrening (TAP)-metoden med hjälp av väl karakteriserade eukaryota translationsinitiering FACTor eIF4E ^9,10. Den cellulära översättningen faktorn eIF4E är en kritisk komponent i cellulära eIF4F komplexet involverade i Cap-beroende translationsinitiering ^10. TAP taggen används i den aktuella studien är sammansatt av två enheter protein G och ett streptavidin-bindande peptid separeras genom en tobacco etch virus (TEV) proteas-klyvningssekvensen. TAP taggen används i den aktuella studien är sammansatt av två enheter protein G och ett streptavidin-bindande peptid separeras genom en tobacco etch virus (TEV-proteas) klyvningssekvens ^8. Att avstå från behovet av generering av klonala cellinjer, har vi utvecklat ett system för snabbt som bygger på uttrycket av TAP-märkta bete protein från en episomalt upprätthålls plasmid baserad på pMEP4 (Invitrogen). Uttryck av taggade mus eIF4E från denna plasmid kontrollerades med hjälp av kadmiumklorid promotorn inducerbar metallotionein.

Lys av celler som uttrycker och efterföljande affinitetsrening via bindning till rabbit IgG agaros, TEV-proteas klyvning, bindning till streptavidin kopplat agaros och efterföljande eluering biotin funnit många proteiner uppenbarligen är specifika för eIF4E nedkretsen (jämfört med kontroll-cellinjer som uttrycker den TAP-taggen enbart). Identiteterna för de proteiner som erhålls genom utskärning av banden från 1D SDS-PAGE och efterföljande tandemmasspektrometri. De identifierade komponenter som ingår kända eIF4E bindande proteiner eIF4G och 4EBP-1. Dessutom kan andra komponenter i eIF4F komplex, av vilka eIF4E är en komponent identifierades, nämligen eIF4A och poly-A-bindande protein. Förmågan att identifiera inte bara kända direkta bindande partners samt sekundära samverkande proteiner, understryker ytterligare nyttan av detta synsätt i karakterisering av proteiner av okänd funktion.

Protocol

1. Generering av cellinjer: pMEP4 transfektion / uttryck Transfektera cellerna med pMEP4 expressionsvektor och väljer med 100 | ig av hygromycin B / ml (Roche) till dess att alla mock-transfekterade celler har dödats av. Den pMEP4 plasmiden bibehålls episomalt så det finns inget behov av att isolera specifika kloner. Celler som innehåller den pMEP4 vektorn kan induceras genom behandling med 10 | iM CDCl 2 under 16 timmar. Uttryck och inducerbarheten skall bekräftas i liten skala innan förstärkning av de cellinjer. TAP-märkt protein kan lätt detekteras eftersom de protein G-domänerna binder till antikroppar från nästan alla arter. För storskaliga reningar normalt 10 konfluenta 175 cm2 kolvar av celler krävs. Detta motsvarar ca 2 X10 8-uttryckande celler. 2. Cellysatet beredning Skrapa cellerna i PBS och kombineras till ett enda 50 ml rör. Snurra 1200X gfeller 5 minuter (detta skulle resultera i 2-3 ml packade celler till att börja med, vilket minskar till ca 1,5 ml efter tvättning). Tvätta cellerna tre gånger i iskall PBS (50 ml varje gång). Lyserar celler i 5 ml lysbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% NP-40, 1,5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM Na-3 VO 4 och proteasinhibitor ). Notera: NaF, Na 3 VO 4 och proteashämmare bör läggas färsk. Pipettera upp och ner 10 gånger innan avresa till 5 minuter på is. Sprutor upp och ner 5-10 gånger med en trubbig nål innan de lämnar igen på is i 5 minuter på is. Upprepa insprutning och låt stå i ytterligare 5 minuter på is. Frys-tö-lysatet två gånger (flytande N2 / eller torr is och etanol). Tillåter inte provet för att nå större än 4 ° C. Obs: Du kan spara denna provet vid -80 ° C tills du har tid att bearbeta. Alikvot i 1,5 ml rör och avlägsna icke lyserade celler och debris genom centrifugering (10 minuter vid 4 ° C, 16,000 x g). Recover supernatanten kombineras i ett 15 ml Falcon rör och (valfritt) passera genom ett 0,45 m filter innan en 20 ^ prov för proteinavkastning kvantifiering. Ta bort en ytterligare 50 pl alikvot för senare analys (prov 1). 3. Bindning till kanin-IgG-agaros (Notera: Alla snurrar bör utföras vid 1200X g i en kyld centrifug vid 4 ° C under 1 minut, om inte annat anges) Försiktigt och resuspendera kanin-IgG-agaros (Sigma-Aldrich) genom virvling flaska. Ta 380 pl IgG agaros (med en cut 1 ml pipettspets) och ta bort sjöfart / konserverande lösning genom centrifugering under 1 minut. Tvätta agaros tre gånger i kyld lys-buffert (4 ° C) med användning av centrifugering för att klargöra. Det slutliga utbytet av agaros bör vara omkring 250 | il packade pärlor. Tillsätt rensas cellysatet från 2,6 (för en 15 ml Falcon-badkare) att den tvättade kanin-IgG-agaros och inkubera under 3 h (eller över natten) vid 4 ° C med användning av en roterande bländare. Centrifugera ner de agaroskulor under 5 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten för efterföljande analys (prov 2). Notera: TAP märkt protein bör nu vara associerad med pärlorna. 4. TEV-proteas klyvning (Notera: Alla snurrar bör utföras vid 1200X g i en kyld centrifug vid 4 grader Celsius under 1 minut, om inte annat anges) Tvätta de kanin-IgG-agarospärlor tre gånger i kyld lys-buffert (4 ° C) med användning av centrifugering för att klargöra (notera: lysbufferten bör inte innehålla proteasinhibitorer). Försiktighet bör iakttas att inte ta bort eller förlora några kulor under tvättningsstegen. Tvätta pärlorna ytterligare två gånger med TEV-proteaset klyvning buffert (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl och 0,2% NP-40) med användning av centrifugering för att klargöra. Efter den sista tvättningen försiktigt ta bort alla liquid från pärlorna. Framställa en TEV blandning proteasklyvningsställe; för varje prov innefattar 467,5 | il H2O, 25 ^ il 20 x TEV buffert (Invitrogen), 5 pl 0,1 M DTT och 2,5 pl (25 U) TEV-proteas (Invitrogen). Tillsätt 500 pl av denna TEV klyvning blandningen till varje prov av packade pärlor och överföra hela blandningen till en 1,7 ml i förväg smorda rör (Costar). Före inkubering avlägsna en 30 pl alikvot för efterföljande analys (prov 3). Inkubera TEV-proteas reaktion över natten vid 4 ° C med användning av en roterande bländare. Observera att kortare inkubation tider kan användas beroende på vilken typ av betet protein och tillgänglighet TEV proteasklyvningsställe men minimal inkubationstiden bör bestämmas empiriskt. 5. Bindning till ULTRALINK immobiliserat streptavidin Plus pärlor (Notera: Alla snurrar bör utföras vid 1200X g i en kyld centrifug vid 4 ° C under 1 minut, om inte annat anges) </p> Centrifugera TEV klyvningsreaktionen innehållande kanin-IgG-agarospärlor under 5 minuter vid 1200X g (4 ° C). Avlägsna en 20 ul alikvot av den klarnade supernatanten för analys (prov 4) Överföra den återstående supernatanten (ca 480 | il) till en färsk 1,5 ml i förväg smorda rör (Costar) och lämnar detta på is. Kasta inte bort denna supernatant – denna innehåller din TEV kluvna bete protein och tillhörande bindande proteiner. Tillsätt 500 ul av kyld lyseringsbuffert (avsnitt 2,3) till de återstående kanin IgG agaroskulor och slamma. Centrifugera denna blandning för att klargöra pärlorna innan du tar bort supernatanten och kombinera det med det från steg 5,2. Lämna denna röret på is (det bör nu innehålla ~ 980 pl prov). Kvarhålla kanin IgG-agarospärlor för efterföljande analys (prov 5). Obs: om du kör det här exemplet på en SDS-PAGE gel (eller Western blot) kommer det att ge en hel del av bakgrund på grund av närvaron av IgG tunga och lättakedjor. Samtidigt försiktigt och resuspendera ULTRALINK immobiliserat streptavidin Plus agarospärlor (Pierce) genom att snurra flaskan. Användning av en 200 mikroliter pipettspets med utgången i bitar, alikvot 70 pl av streptavidinpärloma per prov i förväg smorda 1,5 ml rör och avlägsna transport / konserverande lösning genom centrifugering. Notera: dessa pärlor är mycket liten och så "anka-fakturerade" eller platt / smal ändar spetsar kan användas för att minimera förlust av pärlor under tvättning. Tvätta de streptavidinpärloma tre gånger i kyld lys-buffert (4 ° C) med användning av centrifugering för att klargöra. Detta bör lämna ca 45-50 pl av packade pärlor per rör. Överföra TEV-proteas klyvning supernatanten (dvs. 980 | il av provet från steg 5,3) till röret innehållande de tvättade streptavidinpärloma och inkubera under 3 h (eller över natten) vid 4 ° C med användning av en roterande bländare. Centrifugera ner streptavidinpärloma under 5 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten för efterföljande analys (Sampel 6). Tvätta de streptavidinpärloma tre gånger i kyld lys-buffert (4 ° C) med användning av centrifugering för att klargöra. Efter den slutliga tvätten, försiktigt bort all kvarvarande tvättbuffert. 6. Biotin eluering av streptavidin bindande peptiden och betesprotein (Notera: Alla snurrar bör utföras vid 1200X g i en kyld centrifug vid 4 ° C under 1 minut, om inte annat anges) Eluera märkta proteiner från de streptavidinbelagda kulorna genom tillsats av 500 | il PBS: biotin (1 mM D-biotin) och inkubering vid 4 ° C under 3 timmar (eller över natten) med användning av en roterande bländare. Centrifugera ner streptavidinpärloma under 5 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten till en 1,5 ml i förväg smorda rör (Notera: Detta är den slutliga provet / eluering (prov 7). Lägga till ytterligare 500 ^ il biotin: PBS till de återstående streptavidinpärloma och inkubera vid 4 ° C under 2-3 timmar (eller över natten) med användning av en roterande bländare. Retorv steg 6,2 och kombinera de två elueringar (prov 7). Denna slutliga elueringen kan lagras vid -80 ° C. För att bedöma effektiviteten av biotin elueringen, frysa återstående streptavidinpärloma och koka sedan i SDS provbuffert (prov 8) (rekommendationer: LaneMarker 5x reducerande provbuffert från Fisher). 7. Proteinkoncentrationen Det slutliga eluatet (prov 7) måste koncentreras före analys på grund av den låga proteinkoncentrationer och relativt hög volym. Detta kan uppnås genom användning av låg molekylvikt (<5 kda) vivaspin spinnkolonner (vivascience). sikta på att koncentrera volymen till mindre än 100 pl. denna sista prov kan kokas och lagras i protein provbuffert (rekommendationer: lanemarker 5x reducerande från fisher). 8. analys proverna 1-8 analyseras med western blöt för bestämma effektiviteten av pull down. obs: de flesta sekundära antikroppar kommerkorsreagerar domäner g fusionsproteinet men detta avlägsnas efter tev-proteas klyvning. 7 genom 1d eller 2d sds-page. färgning utföras användning silver coomassie (rekommendationerna: silverquest silverfärgning kolloidal blue kit invitrogen). proteinidentifiering masspektrometri. 9. representativa resultat ett exempel sds-page-analys den slutliga elueringen (prov 7) protokoll identifiera bindande partners tap taggade eif4e tillhandahålls figur 2. gelén visar komplexa riklig natur interaktioner andra proteiner cellen. jämförelse negativa kontrollen också visas 2, genereras en cellinje som uttrycker endast tap-taggen, illustrerar specificiteten betade neddragningstransistor. fall 15% koncentrerade (prov7) analyserades sds-page kommersiellt tillgängliga förtillverkade gradientgeler innan färgades kitet invitrogen. typiskt 50-85% återstående kouoidal coomassie-färgning (invitrogen). (gelskivor >

Discussion

TAP märkning som illustreras här visar en hög specificitet och stringenta förfarande för isolering av de bindande partnerna av bete proteiner i eukaryota celler. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på både cellulära och virala proteiner. Såvitt vi vet är detta första gången en sådan teknik har använts på translationsinitiering faktorn eIF4E. Identifiering av kända eIF4E bindande proteiner eIF4G och 4EBPs med denna teknik bekräftar giltigheten av ett sådant tillvägagångssätt. Dessutom, identifiering av den återstående delen av eIF4F komplex bekräftas nämligen eIF4A och PABP att indirekt interaktion och tertiära komplex förblir intakt under reningsprocessen. Identifieringen av multipla isoformer av de kanoniska eIF4e bindande proteiner var också tydlig. Dessa beskrivs mer i detalj i figur 2.

När det gäller begränsningarna i metoden bör vissa försiktighet iakttas när det gäller valetav betesprotein och huruvida eller inte för att placera taggen TAG vid N-eller C-terminalen. Det kan vara tillrådligt att utföra en funktionell analys eller undersöka den lokalisering av fusionsproteinet med hjälp av mikroskopi före full skala rening för att säkerställa den märkta derivatet är funktionell. Integralt membranprotein eller nukleära proteiner behöver inte nödvändigtvis att frigöras från de relativt milda rengöringsmedel förhållanden som beskrivs i lyssteget. Som med alla immunoutfällningar och liknande pull-down-analyser, kan modifieringar göras av arten och koncentrationen av detergenten i lysbuffert för att öka effektiviteten av lys. Jonkoncentrationen av lys och tvätt buffertar kan också modifieras för att öka eller minska stringens för rening. Det är också möjligt att utföra den inledande reningen under normala milda förhållanden (beskrivet ovan), men därefter dela streptavidinpärloma (avsnitt 5,8) i 4-5 portioner, som därefter kan tvättas under allt joniska konförutsättningar. Detta kan göra det möjligt för användaren att identifiera de optimala betingelser som avlägsnar icke-specifika interagerande proteiner. Hela processen kan också genomföras med användning av transient transfektion där de samverkande partner är kända och deras närvaro eller frånvaro bestämdes genom efterföljande Western blöt endast. I det här fallet skulle vi föreslå två 100cm ² skålar av celler varje transfekterad med 8 pg av expressionsplasmiden. Denna modifierade procedur är särskilt användbar vid undersökning av förmågan hos muterade derivat av den TAP-fusionsproteinet för att samverka med kända bindningspartners.

Analys av prover 1 till 8 på silverfärgade SDS-PAGE-geler (eller genom western blöt om en antikropp är tillgänglig) är ett utmärkt sätt felsökning, bör den teknik misslyckas med att generera ett acceptabelt resultat. Effektiviteten av varje affinitet baserade nederbörd och specifika eluering kan analyseras med denna systematiska urvalsmetod. Prover en till åtta bör vidtas under Optimnisation av protokollet för varje ny bete.

TAP märkning Tekniken ger ett kraftfullt och robust alternativ till andra metoder såsom GST nedkretsarna, jäst två hybrid analyser etc. Den dubbla affinitetsrening och särskilda åtgärder elueringsbetingelser (TEV klyvning och biotin eluering) ger specificitet och stringens hållas vid en hög nivå under hela reningsförfarandet. Kritiskt denna teknik kan tillämpas på vilket protein som helst och därför representerar en utmärkt metod för att identifiera bindande partners för ett protein målet av intresse.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Hygromycin B	Roche	10843555001
Rabbit IgG Agarose	Sigma	A2909
AC-TEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease inhibitor cocktail	Calbiochem	539134
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads	Pierce	53116
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa)	Vivaspin	V50112
SilverQuest silver staining kit	Invitrogen	LC6070
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit	Invitrogen	LC6025
1.7ml prelubricated tubes	Costar	3207
Microcapillary pipette tips	VWR	37001-150
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels	Invitrogen	NP0322BOX
CdCl2	Sigma	202908
5x SDS Sample Buffer	Fisher	PN39000