Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro Yaklaşım
Summary
Ile bitki hücreleri için birden fazla viral bileşenlerinin teslim senkronize etmek için basit, verimli ve sağlam bir yol<em> Agrobacterium</em>-Aracılı geçici ifade tarif edilmektedir. Bu yaklaşım, çoğaltma çalışmaları için müsait, encapsidation izledi<em> In vitro</em> Reassembly genomuna viral olmayan bileşenleri biyomedikal uygulamaları için uygun optik viral hayaletler tüketilmiş.
Abstract
Insan, hayvan ve bitkiler, yavrulama encapsidation olgun ve kararlı virionlar içine kadar pozitif polariteli RNA genomu patojen olan virüsler belirli bir konak enfeksiyon kurulması sırasında bir kardinal aşamasıdır. Sonuç olarak, encapsidation çalışma know-how bulaşıcı virionlar oluşturmak için virüs montaj düzenleyen mekanizmasının ilişkin bilgileri tercümesini. Bu bilgiler, virüs yaymak ve hastalık kontrolü düşürücü yeni yöntemler oluşturulmasında hayati önem taşımaktadır. Virüs encapsidation in vivo ve in vitro olarak ele alınabilir. In vivo Genom encapsidation makromoleküler etkileşimleri ve hücre içi kompartımanlara içeren oldukça düzenli bir seçici bir süreçtir. Bu nedenle, in vivo virüs encapsidation kapsayan olaylar virüsler çoğalır ve montajı nasıl anlamak için temel bilgi sağlayacaktır incelemek önde gelen eğitim. Son zamanlarda in vitro encapsidation biyomedikal ima alanında araştırma için istismar edilmiştirging ve terapötik uygulamalar. Zarfsız bitki virüslerinin negatif yüklü yabancı madde in vitro encapsidation içinde bir girişim çok daha önde duruyor. Brom mozaik virüsü (BMV), bitkiler için bir zarfsız çok bileşenli bir RNA virüsünün patojenik, in vivo ve in vitro paketleme genomunun çalışmak için bir model olarak sistemi kullanılmıştır. Nicotiana benthamiana bitkilerde encapsidation testlerde, Agrobacterium geçici ifadesi, agroinfiltration dediğimiz aynı hücreye birden çok bileşenden senkronize teslimat ve ifade için verimli ve güçlü bir tekniktir. Bu yaklaşımda, desiredviral mRNA'ların cDNAlarının taşıyan ikili plazmid vektörler taşıyan Agrobacterium tumefaciens bir hücre süspansiyonu 1 ml tek kullanımlık şırınga (iğne olmadan) daha karmaşık bir şey kullanarak hücrelerarası boşluk withina kanadı içine sızmış edilir. Bitki hücrelerine DNA ekleme devri içinde Bu işlem sonucu; T-DNAinsert çekirdeğinde geçici olarak kalır ve daha sonra ev sahibi polimeraz II transkripsiyonu olduğunu, geçici ekspresyonunu. Çıkan mRNA transkript (kep ve polyadenylated) sonra çeviri için sitoplazma ihraç edilmektedir. Inkübasyon yaklaşık 24 ila 48 saat sonra, infiltre yaprakların bölümleri microscopyor biyokimyasal analizler yapılabilir. Agroinfiltration eşzamanlı olarak transfekte edilmesi için hücreler, çok sayıda (yüz binlerce) verir. In vitro encapsidation içinde için, BMV arındırılmış virionlar santrifüjle RNA ve un-ayrışmış virionlar uzaklaştırılması ile devam ayrışma tampon içeren kalsiyum klorür karşı diyaliz tarafından kapsid proteini içine ayrışmış bulunmaktadır. Genom tüketilmiş kapsid proteini alt birimden daha sonra arzu edilen viral genom bileşenleri veya bu tür boya indosiyanin gibi viral olmayan bileşenleri ile yeniden birleştirilen edilir.
Protocol
Discussion
Burada sunulan Agroinfiltration yaklaşımı yaygın olarak bitki virüsleri, geniş bir aralık uygulanabilir olabilir. Bu yaklaşımın bir işaretidir özelliği aynı hücre-sık bitki virüsleri rutin olarak kullanılan mekanik inokulasyon ile ilişkili büyük dezavantajı birden çok agroconstruct teslim eşitlenir. In vivo ve bir model olarak brom mozaik virüsü kullanılarak in vitro montaj çalışmaları ile verimli bir şekilde yapılabilir Aşağıdaki birkaç ipucu. (i) N.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar agroinfiltration geliştirilmesi ve in vitro montaj deneylerinde değerli önerileri için laboratuvar birkaç üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, California Üniversitesi'nden bir hibe ile finanse edildi. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CBET-1.144.237) tarafından verilen bir hibe bölgelerinde desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
