Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof uit<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Het model organisme<em> C. elegans</em> Gebruikt pseudocoelomic vloeistof als een passieve bloedsomloop. Directe bepaling van deze vloeistof niet eerder mogelijk. Hier presenteren we een nieuwe techniek om direct test de extracellulaire ruimte, en het gebruik van systemische silencing signalen tijdens een RNAi respons als een proof of principle voorbeeld.
Abstract
De genetisch soepel model organisme C. elegans heeft inzicht in een groot aantal biologische vragen, mogelijk gemaakt door de korte generatietijd, gemakkelijke groei en kleine omvang. Deze kleine afmetingen, maar is afgewezen voor een aantal technische benaderingen in andere modelsystemen. Bijvoorbeeld, schakelt u bloedtransfusies in zoogdiersystemen en enten technieken in planten vragen te stellen aan de bloedsomloop samenstelling en signalering. De bloedsomloop van de worm, de pseudocoelom, Tot voor kort was het onmogelijk om direct assay. Om vragen van intercellulaire signalering en de bloedsomloop samenstelling C. beantwoorden elegans onderzoekers hebben van oudsher zich tot genetische analyse, cel / weefsel-specifieke redding, en mozaïek analyse. Deze technieken leveren een middel om duidelijk wat er gebeurt tussen cellen, maar niet universeel toepasbaar bij de identificatie en karakterisering van extracellulaire moleculen. Hier presenteren we een newly ontwikkelde techniek direct assay pseudocoelomic de vloeistof van C. elegans. De techniek begint met hetzij genetische of fysieke manipulatie het volume van de extracellulaire vloeistof. Daarna worden de dieren onderworpen aan een reverse vampiric micro-injectie waarbij gebruik wordt microinjectie rig die fijne balans drukregeling toelaat. Na isolatie van extracellulaire vloeistof, kan de verzamelde vloeistof worden getest door overdracht in andere dieren of door moleculaire middelen. Om de effectiviteit van deze techniek zien we een gedetailleerde benadering assay een specifiek voorbeeld van extracellulaire signaalmoleculen, lang dsRNA tijdens een systemische respons RNAi. Hoewel karakterisering van systemische RNAi is een proof of principle voorbeeld zien we deze techniek als aan te passen aan een verscheidenheid van vragen van bloedsomloop samenstelling en signalering te beantwoorden.
Protocol
Discussion
We hebben hier gepresenteerd een nieuwe methode die de isolatie en karakterisering van extracellulair vocht kan het modelorganisme C. elegans. De techniek begint met de genetische of fysieke manipulatie van donor wormen tot het totale volume van de extracellulaire vloeistof verhogen. Extracellulaire vloeistof wordt vervolgens geïsoleerd met een gemodificeerde micro-injectie techniek. De wormen zijn gemonteerd voor micro-injectie met behulp van droge agarose pads om stil te houden de wormen in de loop van de pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de collaboratieve aard van de Hunter lab te erkennen, en dank hen voor de nuttige discussie en hulp dat maakte de ontwikkeling van deze techniek mogelijk en plezier. We willen graag Nigel Delaney en de Caenorhabditis Genetics Centrum voor worm en bacteriestammen bedanken. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health GM089795 subsidie aan CPH.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. 유전학. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
