Vampiric Isolamento de fluido extracelular a partir de<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
O organismo modelo<em> C. elegans</em> Usa fluido pseudocoelomic como um sistema circulatório passiva. Ensaio directo desse fluido não tem sido possível anteriormente. Aqui apresentamos uma nova técnica para ensaio diretamente do espaço extracelular, e usar sinais sistêmicos silenciamento durante uma resposta RNAi como uma prova de princípio exemplo.
Abstract
O organismo geneticamente tratável modelo C. elegans tem fornecido informações em uma miríade de questões biológicas, habilitado pelo seu tempo de geração curto, facilidade de crescimento e tamanho pequeno. Este pequeno tamanho, no entanto, não permitiu um certo número de abordagens técnicas encontradas em outros sistemas de modelos. Por exemplo, as transfusões de sangue em mamíferos e técnicas de enxertia em plantas permitem fazer perguntas de composição sistema circulatório e sinalização. O sistema circulatório do worm, o pseudoceloma, até recentemente sido impossível ensaio diretamente. Para responder as questões de sinalização intercelular e sistema circulatório composição C. elegans pesquisadores têm tradicionalmente virou-se para análise genética, a célula / tecido específico de salvamento, e análise de mosaico. Estas técnicas proporcionam um meio para se inferir o que se passa entre as células, mas não são universalmente aplicáveis na identificação e caracterização de moléculas extracelulares. Apresentamos aqui uma newly técnica desenvolvida para o fluido de ensaio directamente pseudocoelomic de C. elegans. A técnica começa com qualquer manipulação genética ou física para aumentar o volume de fluido extracelular. Depois os animais são submetidos a uma técnica de micro-injecção reversa vampiric utilizando um equipamento que permite a micro-injecção de controlo de pressão fino equilíbrio. Após o isolamento do fluido extracelular, o fluido recolhido pode ser testada por transferência para outros animais, ou por via molecular. Para demonstrar a eficácia da presente técnica é apresentada uma abordagem detalhada do ensaio de um exemplo específico de moléculas de sinalização extracelulares, dsRNA longo durante uma resposta sistémica RNAi. Apesar de caracterização de RNAi sistêmica é uma prova de princípio exemplo, vemos esta técnica como sendo adaptável para atender uma variedade de questões de composição sistema circulatório e sinalização.
Protocol
Discussion
Nós apresentamos aqui um novo método que permite o isolamento e caracterização de fluido extracelular a partir do modelo de organismo C. elegans. A técnica começa com a manipulação genética ou física de vermes dos doadores para aumentar o seu volume total de fluido extracelular. Fluido extracelular é então isolado utilizando uma técnica de micro-injecção modificada. Os sem-fins são montados por microinjecção utilizando almofadas de agarose secos para manter os vermes ainda durante o procedimen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer a natureza colaborativa do laboratório de Hunter, e agradecê-los para a discussão útil e assistência que fez do desenvolvimento desta técnica possível e divertido. Gostaríamos de agradecer a Nigel Delaney eo Caenorhabditis Genética Centro de verme e cepas bacterianas. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health GM089795 subvenção para CPH.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
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