Vampiric выделение внеклеточной жидкости из<em> Caenorhabditis Элеганс</em
Summary
Модель организма<em> C. Элеганс</em> Использует pseudocoelomic жидкости в качестве пассивной системы кровообращения. Прямой анализ этой жидкости не было возможно ранее. Здесь мы представляем новый метод анализа непосредственно в межклеточное пространство, а также использовать системные сигналы глушителя во время ответа RNAi как доказательство принципа пример.
Abstract
Генетически послушной моделью организма C. Элеганс предоставил взглянуть на множество биологических вопросов, включен по своим коротким временем генерации, простота роста и небольшого размера. Этот небольшой размер, однако, имеет запретил ряд технических подходов в других модельных системах. Например, переливания крови в системах млекопитающих и методы пересадки растений позволяют задавать вопросы кровообращения состав системы и сигнализации. Кровеносная система червя, pseudocoelom, до недавнего времени было невозможно анализа напрямую. Чтобы ответить на вопросы межклеточной сигнализации и системы кровообращения состава C. Элеганс исследователи традиционно обратился к генетическому анализу, клеток / тканей конкретных спасения, и мозаика анализа. Эти методы дают возможность сделать вывод, что происходит между клетками, но не универсально применимые в выявлении и характеристике внеклеточных молекул. Здесь мы представляем пеwly разработанной методики непосредственного анализа pseudocoelomic жидкость C. Элеганс. Техника начинается либо с генетическими или физические манипуляции для увеличения объема внеклеточной жидкости. После этого животные подвергаются микроинъекции вампиров обратном технологии с использованием микроинъекций буровой установки, которая позволяет удобно управлять давлением баланса. После выделения внеклеточной жидкости, собранной жидкости может быть анализировали с помощью перевода на других животных или молекулярных средств. Чтобы продемонстрировать эффективность этой методики мы представляем детальный подход для анализа конкретных примеров внеклеточных сигнальных молекул, длинные дцРНК в системный ответ RNAi. Хотя характеристика системного RNAi является доказательством принципа, например, мы видим, эта техника как адаптироваться, чтобы ответить на различные вопросы кровообращения состав системы и сигнализации.
Protocol
Discussion
Мы представили здесь новый метод, который позволяет выделение и характеристика внеклеточной жидкости из модельного организма C. Элеганс. Техника начинается с генетической или физические манипуляции доноров червей увеличить их общего объема внеклеточной жидкости. Внеклеточной ж…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить совместный характер Hunter лаборатории, и поблагодарить их за полезные обсуждения и помощь, которая сделала развития этой техники возможно и весело. Мы хотели бы поблагодарить Найджела Делани и Caenorhabditis генетический центр для червя и бактериальных штаммов. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья GM089795 грант CPH.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. 유전학. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
