Luce Correlativo e Microscopia Elettronica (CLEM) come strumento per visualizzare molecole microiniezione e dei loro sub-cellulari eucariotiche Obiettivi
Summary
La tecnica CLEM è stato adattato per analizzare morfologia ultrastrutturale delle membrane, organelli e strutture subcellulari affetti da molecole microiniezione. Questo metodo combina le potenti tecniche di micromanipolazione / microiniezione, microscopia confocale a fluorescenza, e la microscopia elettronica per consentire millimetro a multi-risoluzione nanometrica. Questa tecnica è suscettibile di una vasta gamma di applicazioni.
Abstract
La cellula eucariotica si basa su complessi, altamente regolamentato, e compartimenti di membrana funzionalmente distinti associati, che conservano una polarità biochimica necessaria per una corretta funzione cellulare. Capire come gli enzimi, proteine, e componenti del citoscheletro governare e mantenere questa separazione biochimica è quindi di fondamentale importanza. L'utilizzo di molecole fluorescenti tag di localizzare e / o turbano compartimenti subcellulari ha prodotto un patrimonio di conoscenze e avanzato la nostra comprensione della regolazione cellulare. Tecniche di imaging come la microscopia confocale a fluorescenza e rendere esaminano la posizione di una molecola fluorescente etichettato piccola relativamente semplice, tuttavia la risoluzione di strutture molto piccole è limitato 1.
D'altra parte, microscopia elettronica ha rivelato i dettagli di morfologia subcellulare ad altissima risoluzione, ma la sua natura statica rende difficile misurare pro altamente dinamicoprocessi con precisione 2,3. Pertanto, la combinazione di microscopio ottico con il microscopio elettronico dello stesso campione, chiamato Luce correlativa e Microscopia Elettronica (CLEM) 4,5, offre il duplice vantaggio di imaging fluorescente con ultraveloce ad alta risoluzione della microscopia elettronica 6. Questa potente tecnica è stata implementata per studiare molti aspetti della biologia cellulare 5,7. Fin dalla sua nascita, questa procedura ha aumentato la nostra capacità di distinguere architetture subcellulari e morfologie ad alta risoluzione.
Qui, presentiamo un metodo semplificato per eseguire microiniezione rapida seguita da CLEM (Fig. 1). La procedura CLEM microiniezione può essere utilizzato per introdurre quantità specifiche di piccole molecole e / o proteine direttamente nel citoplasma delle cellule eucariotiche e studiare gli effetti di millimetro a multi-nanometri risoluzione (Fig. 2). La tecnica si basa sul microinjectingcellule coltivate su vetrini con laser a griglia applicata sul fondo dei piatti cellule vive e immagini sia con la microscopia confocale a fluorescenza ed elettronica. Localizzazione della cella (s) di interesse è facilitata dalla griglia, che viene facilmente trasferita, insieme con le cellule di interesse, alla resina Epon utilizzato per l'immobilizzazione di campioni e sezionamento prima analisi microscopia elettronica (Fig. 3). Sovrapposizione di immagini fluorescenti e EM permette all'utente di determinare la localizzazione subcellulare nonché eventuali cambiamenti morfologici e / o ultrastrutturali indotte dalla molecola microiniezione di interesse (Fig. 4). Questa tecnica è suscettibile di punti di tempo variabili da ≤ 5 s fino a diverse ore, a seconda della natura del campione microiniezione.
Protocol
Discussion
Il metodo qui presentato permette la fornitura diretta di proteine purificate, acidi nucleici, o piccole molecole nel citoplasma eucariotico e offre ultra analisi ad alta risoluzione attraverso la correlazione di microscopia a fluorescenza ed elettronica. L'uso di questo metodo è semplice ma robusto e possono essere eseguite in-house con molti servizi di base esistenti e / o opportunamente attrezzati laboratori di microscopia elettronica. La tecnica è anche soggetto a live-cella, permettendo all'utente d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Alto per le discussioni utili. Ringraziamo anche lo strumento per imaging molecolare e cellulare del Southwestern Medical Center, in particolare il dottor Chris Gilpin, Tom Januszewski, e Laurie Mueller per la competenza tecnica e consulenza. Ringraziamo anche il Dott. Xionan Dong per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è sostenuto da NIH sovvenzione AI083359 a NMA
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Photoetched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Scientific | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instruments | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica | EM UC6 |
References
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