Ex vivo mimetismo de la hematopoyesis humano normal y anormal
Summary
Un sistema de cultivo en 3D para la hematopoyesis se describe utilizando sangre del cordón umbilical humano y células leucémicas de médula ósea. El método se basa en el uso de un poliuretano poroso sintético andamio revestido con proteínas de matriz extracelular. Este andamio es adaptable para acomodar una amplia gama de células.
Abstract
Las células madre hematopoyéticas requieren un microambiente único fin de mantener una formación de células sanguíneas, la médula ósea (MO) es un complejo de tres dimensiones (3D) del tejido hematopoyesis en el que se regula por espacialmente organizadas microambientes celulares llamado nichos de 2-4. La organización de los nichos BM es crítica para la función o disfunción de lo normal o maligno BM 5. Por lo tanto una mejor comprensión del microambiente en vivo utilizando una mímica ex vivo nos ayudaría a aclarar los determinantes moleculares, celulares y microambientales de leucemogénesis 6.
En la actualidad, las células hematopoyéticas se cultivan in vitro en frascos de cultivo de dos dimensiones (2D) de tejidos o bien placas 7 que requieren ya sea co-cultivo con alogénica o xenogénica las células del estroma o la adición de citoquinas exógenas 8. Estas condiciones son artificiales y difieren de la in vivo </em> microambiente en que carecen de los nichos celulares 3D y exponer las células a las concentraciones de citoquinas anormalmente altos que pueden resultar en la diferenciación y la pérdida de pluripotencia 9,10.
Aquí, presentamos una novela de la médula ósea en 3D sistema de cultivo que simula el ambiente in vivo el crecimiento en 3D y es compatible con la hematopoyesis multilinaje en ausencia de factores de crecimiento exógenos. El altamente porosa andamio utilizado en este sistema de poliuretano (PU), facilita la alta densidad crecimiento celular a través de un área de superficie específica mayor que el cultivo en monocapa convencional en 2D 11. Nuestro trabajo ha indicado que este modelo apoyado el crecimiento de sangre de cordón umbilical humano (CB), las células mononucleares (MNC) 12 y primarios células leucémicas en la ausencia de citoquinas exógenas. Esta novela mímica 3D proporciona una plataforma viable para el desarrollo de un modelo humano experimental para estudiar la hematopoyesis y para explorar nuevos tratamientos para la leucemia.
Protocol
Discussion
El sistema de cultivo ex vivo en 3D que aquí se presenta, nos permite establecer una biomimética 3D de la hematopoyesis que resume la arquitectura original BM y fenotipo celular independiente de citocinas exógenas. El modelo 3D proporciona la estructura y el microambiente que permite a las células hematopoyéticas normales y anormales de proliferar en condiciones similares a las encontradas in vivo.
La selección del material de soporte polimérica representa un paso cr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Fondo de Richard Thomas, la leucemia, la señora Tata Memorial Trust, el Northwick Park Hospital Leucemia Fondo de Investigación del Fideicomiso y el Instituto Nacional de Investigación en Salud (NIHR), Reino Unido.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue No |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 |
| PBS | Gibco | 14190-094 |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 |
| MTS | Promega | G3580 |
| Glutaraldehyde | Fluka Biochemika | 49624 |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10108-165 |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32272 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 |
| CD45-FITC | BD Pharmigen | 74895 |
| CD71-PE | BD Pharmigen | 555537 |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Pharmigen | 555570 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
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