Закрытые нуклеиновых кислот цитометрии потока флуоресценции На месте Гибридизация (LNA поток-FISH): Метод бактериального Малый обнаружения РНК

Summary

Роман высокой пропускной описан метод, который позволяет обнаружение и относительной количественного малых РНК и экспрессию мРНК из одного бактериальных клеток с использованием заблокирован нуклеиновых кислот зондов и проточной цитометрии флуоресценции<em> На месте</em> Гибридизации.

Abstract

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination^1,2, cellular identification and gene expression^3,4, monitoring viral multiplication in infected cells⁵, and bacterial community analysis and enumeration⁶.

Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (T_m) of these analogs for natural nucleic acids^7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence^9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes^7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA¹² and viral RNA in mammalian cells⁵.

Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes¹³. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Protocol

1. МШУ зондов и опытно-конструкторских Дизайн МШУ зондов, которые обратном дополнением вашей транскрипции р-РНК / РНК или их специально созданных на www.exiqon.com . Если вы используете нестандартный дизайн, вы будете знать, последовательности, но не образец МШУ пики. Добавление каждого остатка МШУ в ДНК или РНК олигонуклеотид приводит к увеличению Т м от двух до 10 ° С для МШУ-РНК гибридизации дуплекс 14. В идеале, предназначен зондов МШУ должна быть в пределах 20-25 нуклеотидов в длину (более длинные зонды являются более трудными для синтеза) и Т м между 85-90 ° C для РНК-гибридизации. После разработки последовательности, используйте BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi или сравнивать последовательности зонда к локальной базе данных для обеспечения зонд, характерные только для вашего р-РНК / мРНК интересов. При заказе зонд МШУ, добавляют биотин-TEG модификации до конца 5 'олигонуклеотидных МШУ. Биотинилирование необходимо для пост-гибридизация окрашивания стрептавидин-конъюгированных с красителем. Можно добавить эту модификацию 3 'конец, если необходимо, но дополнение к 5' концу дешевле и должно привести к повышению урожайности. Три отрицательного контроля должны быть включены в метод: (я) контроль »не МШУ", в котором зонд МШУ не добавляется во время гибридизации шаг, (II) управление "нет красителей", в котором зонд МШУ гибридизации с целевой р-РНК, но гибридизации событие не обнаружены из-за отсутствия флуоресцентные пятна, и контроль (III) "не выразил р-РНК / мРНК ', которая использует датчик МШУ, что цели не существуют, либо не-р-РНК выражены в порядке для контроля неспецифической гибридизации. Конкретные зонд МШУ здесь является дополнением к рРНК CsrB и последовательность 5'-биотин-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(LNA мономеров взаглавные буквы). После получения лиофилизированного МШУ, ресуспендируют с нуклеазы без воды до 50 мкг / мл и хранят в 10-20 мкл аликвоты при -20 ° C. Решения 8% paraformaldehye (PFA), 10% уксусной кислоты в PBS: Смешайте 1 мл 32% PFA, 400 мкл уксусной кислоты, 400 мкл 10X PBS, рН = 7,4 и 2,2 мл нуклеазы без воды. Для замороженные порции, заморозить в одной порции использовать при температуре -20 ° С без уксусной кислоты. 60% декстран сульфата решение: добавить 6,0 г декстрана сульфата 50 мл коническую пробирку и добавляют воду до конечного объема 10 мл. Тепло этой смеси до 65 ° С на водяной бане до сульфата декстрана растворяется (может занять 1-2 ч). Дополнительная вода может нужно добавить всей солюбилизации процесса для поддержания объема 10 мл. Алиготе 60% раствора сульфата декстрана и храните при температуре от -20 ° C до использования. 2. Фиксация Урожай 1×10 8 ячеек биолюминесцентных <em> Vibrio campbellii или ваши бактерии интересов и передача их в 1,5 трубки микроцентрифужных мл. Это количество клеток обеспечивает достаточно исходного материала на четыре потока-FISH образцов (один конкретный зонд МШУ образца и трех отрицательных контролей). Дополнительные 1,5 мл аликвоты микроцентрифужных трубка должна быть собрана, если другие р-РНК / мРНК видов должны быть проверены. Гранул бактериальных клеток путем центрифугирования при 2300 мкг в течение пяти минут. Удалите супернатант с помощью пипетки и ресуспендирования клеток в 400 мкл 1X PBS. К этой смеси добавить 400 мкл 8% paraformaldehye (PFA) и 10% уксусной кислоты в 1X фосфатным буферным раствором (1X PBS), решение, хорошо перемешать и инкубировать 10 минут при 25 ° C смешивания один раз через пять минут. Все инкубации, если не указано иное, выполняются в отапливаемом держателя трубки. Решение PFA должны быть готовы использовать свежие или замороженные из аликвот после добавления уксусной кислоты. Параформальдегид является сшивание фиксатором, что чelps сохранить морфологии клетки и сохраняют внутриклеточных РНК. Гранул клетки из этой смеси путем центрифугирования при 4500 мкг в течение двух минут и удалить супернатант с помощью пипетки. Все последующие шаги, которые требуют центрифугирования следует использовать те же настройки (7К, 2 мин). Важно отметить, что после центрифугирования надосадочную жидкость должна быть удалена с помощью пипетки, а не переливание. Вымойте клетки в два раза с 400 мкл 1X PBS и ресуспендируют окончательный осадок клеток в 400 мкл 1X PBS. Клетки исправлено и может храниться при температуре 4 ° С в 400 мкл 1X PBS на срок до семи дней. 3. Диэтиловый pyrocarbonate лечения Подготовка 400 мкл 0,1% раствора диэтилового pyrocarbonate (DEPC) в 1X PBS (400 мкл этого раствора необходимо для каждого образца для тестирования столь масштабного соответственно). DEPC решения должны быть подготовлены только что из DEPC акций. DEPC лечения инактивирует РНКаз по carbethoxylation и уменьшаетсяфонового сигнала. Добавить 400 мкл 0,1% DEPC решение каждого фиксированного бактериальные образцы клеток и хорошо перемешать с помощью пипетки. Выдержите эту смесь при температуре 25 ° С в течение 12 минут. Вымойте клетки в два раза с 400 мкл 1X PBS, гранулы клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. 4. Пермеабилизации Добавить 1,0 мг лизоцима в 1 мл Трис-ЭДТА буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) на 1,0 мг / мл раствора. Это решение должно быть подготовлено свежим. Добавить 800 мкл 1 мг / мл лизоцима решение клетки, тщательно перемешать с помощью пипетки и инкубировать при температуре 25 ° С в течение 30 минут при периодическом перемешивании. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. Лизоцим действует как пермеабилизации реагента путем гидролиза пептидогликана присутствуют в клеточной стенки бактерий. Подготовка 3,0 мкг / мл раствора протеиназы К в буфере TE. Это решение должно быть подготовлено только что из 20 мг / мл протеиназы К акции, которая хранится при температуре -20 ° C.Протеиназы К сериновых протеаз, который переваривает различные белки и помогает доступности зондов и реагентов для РНК. Добавить 800 мкл 3,0 мкг / мл протеиназы К решению осадок клеток и тщательно перемешать с помощью пипетки. Инкубировать при температуре 25 ° С в течение 15 минут с вортексе в середине инкубации. Гранул клеток (7К, 2 мин), удалите супернатант и промыть клетки сразу с 400 мкл 1X PBS. После удаления надосадочной мыть, ресуспендирования клеток в 400 мкл 1X PBS и добавьте 100 мкл ресуспендирования на четыре новые пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. 5. Гибридизация Подготовка по 100 мкл буфера гибридизации (HB) для каждого образца. HB состоит из 50% формамида по объему, 10% декстран сульфата по массе (добавьте 16,7 мкл 60% раствора сульфата декстрана на каждые 100 мкл), решение 1X Денхардта, 50 мМ фосфата натрия рН 7,0,2X цитрата натрия (SSC), 20 мкг стриженой ДНК спермы лосося (SSSD) и 20 мкг тРНК дрожжей. Каждый из компонентов HB имеет свое назначение. Формамид понижает температуру плавления нуклеиновых кислот дуплексы тем самым помогая с денатурации РНК и сведение к минимуму повреждения клеток. Декстран сульфат используется в качестве объема исключая полимер сосредоточиться зонда и увеличения скорости гибридизации. Denhardts решение, дрожжевой тРНК и SSSD служить блокаторы для снижения неспецифического связывания. В каждой из ячейки ресуспендирования содержащие пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных, добавить 95 мкл HB и 5,0 мкл р-РНК / мРНК конкретных LNA [20 пмоль конкретных МШУ конечной концентрации] или воды (не МШУ отрицательный контроль). Например: Труба 1 – 95 мкл HB + 5,0 мкл р-РНК / мРНК конкретных зонд Tube 2 – 95 мкл HB + 5,0 мкл р-РНК / мРНК конкретных зонд (отрицательный контроль "нет красителей) Труба 3 – 95 мкл HB + 5,0 мкл р-РНК/ МРНК зонда («не выразил р-РНК / мРНК" отрицательный контроль) Труба 4 – 95 мкл HB + 5,0 мкл воды (отрицательный контроль "нет LNA) Инкубируйте всех четырех образцов при 60 ° С в течение 60 минут. Гибридизации температура зависит от LNA зонд (ы) Т м и должен быть установлен приблизительно на 30 ° С ниже предсказанных Т м для РНК отжига. Оба повышенной температуре гибридизации и формамида в НВ обеспечивает денатурации вторичная структура р-РНК, или мРНК интересов. 6. После гибридизации моет После гибридизации, добавить 1,0 мл 0.1X SSC с 0,1% Твин-20 (SSCT) для гибридизации смеси. Это необходимо, чтобы клетки должны быть удалены из вязкого раствора гибридизации. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. Добавить 200 мкл 50% формамида, 2X SSC, 0,1% Твин-20 в камеру гранулы, тщательно перемешать и incubел в течение 30 минут при температуре 65 ° С в нагревательном блоке. Добавьте 1 мл 0.1X SSCT к смеси, гранулы клеток (7К, 2 мин) и удалить супернатант. Добавить 500 мкл 0.1X SSCT для ресуспендирования клеток и инкубировать 40 минут при 65 ° С в тепло блоку. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. 7. Блокировка и окрашивание Подготовка блокирующего буфера (BB) и стрептавидин-красителя окрашивание раствора. Подготовка 1X решение BB от 5X акции (имеется в продаже, см. реагенты). Для каждого набора из четырех труб, подготовить 1,2 мл 1X BB. Добавить 200 мкл 1X BB к клетке гранулы, ресуспендирования и инкубировать 30 минут при 25 ° C. Стрептавидин-сопряженных красителя используется для обнаружения биотинилированного зондов МШУ. Хотя блокирование, приготовить раствор из 2 мкг / мл DyLight 488 стрептавидин или желаемый красителя стрептавидин сопряжены в 1X BB в течение 30 мин (для трех образцов, составит 300 мкл). После incubation с 1X BB, гранулы клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. Добавить 50 мкл стрептавидином раствор красителя к клетке гранулы, тщательно перемешать и выдержать в течение 12 минут при 25 ° С при постоянном перемешивании на вихрь или в thermomixer. Для контроля «нет красителей, добавить 50 мкл 1X блокирующего буфера только. Для остальной части протокола, защита труб от света использованием алюминиевой фольги. Вымойте клетки сразу с 500 мкл буфера 0.1X SSCT и один раз с 400 мкл 1X PBS с 0,1% Твин-20 (PBST). Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. После первоначального стрептавидин-сопряженных окрашивания, сигнал усиливается путем введения биотинилированного анти-стрептавидин антитела к стрептавидин-конъюгированных с красителем, а затем окрашивание второй раз с стрептавидином красителя таким образом увеличивая выходной сигнал в гибридизированных МШУ зонда (рис. 2) . Добавить 100 мкл 1 мкг / мл биотинилированного анти-стрептавидин антител в 1X PBS, resuspenг клеток, и инкубировать при температуре 25 ° С в течение 30 минут с редкими смешивания. Гранул клеток (7К, 2 мин), удалите супернатант и мыть два раза с 400 мкл 1X PBST. Добавить 50 мкл 2 мкг / мл стрептавидином раствор красителя в клетки, тщательно перемешать и выдержать в течение 12 минут при 25 ° С при постоянном перемешивании на вихрь или в thermomixer. Для контроля «нет красителей, добавить 50 мкл 1X блокирующего буфера только. Вымойте клетки сразу с 500 мкл буфера 0.1X SSCT и один раз с 400 мкл 1X PBST. Ресуспендируют клеток в 200 мкл 1X PBST и храните при температуре 4 ° С до готовности для анализа потока цитометрии. Для небольших бактериальных клеток набор скорости потока, чтобы замедлить снижение основных размеров. Кроме того, для потока цитометров с порога вперед отключений разброс, отсечка должен быть установлен как можно ниже, чтобы обеспечить небольшой бактериальной клетки обнаружены. Для DyLight 488 обнаружения, Проточный цитометр должен быть оснащен 488 нм лазером и стандарт излученияфильтры для FITC. По крайней мере, 2×10 4 мероприятия должны быть собраны. Для совместимости с потоком цитометров оснащены различными лазерами, другие стрептавидин-сопряженных флуорофоров могут быть использованы для этого протокола. 8. Представитель результаты Например клеток, которые являются фиксированными и проницаемыми эффективно представлена ​​на точку проточной цитометрии участок на рисунке 3А. При использовании описанных выше условиях для пермеабилизации, клеточной популяции небольшой и однородной указывает несколько агрегатов клеток. Когда выше (5 мг / мл) концентрации лизоцима используются, клетки более склонны к агрегации и показывают увеличение разброса значений вперед, что свидетельствует о более крупных частиц (рис. 3В). Пример проточной цитометрии данные из успешных МШУ поток-FISH эксперимента приведена на рисунке 4. Гистограмма показывает, специфической детекции целевых р-РНК вместе с тремя отрицательными элементами управления."Нет красителя" отрицательного контроля производит мере флуоресценции, а затем «нет МШУ» и «не-р-РНК выразил« отрицательного контроля. Наконец, образец с р-РНК конкретных МШУ зонд производит наибольшее флуоресценции. Как только метод и LNA зондов проверяются таким образом, дополнительные эксперименты могут быть разработаны для отслеживания изменений в сигнале р-РНК с течением времени, в ответ на мутации или разнообразных условиях культуры и т.д. Рисунок 1. Изображение общая схема потока МШУ-FISH эксперимент для выявления бактериальных Срна. Рисунок 2. Окрашивание и усиления МШУ поток-FISH сигнала. а) Гибридизация биотинилированного зонд МШУ. б) Окрашивание с люминесцентными DyLight 488 сопряженное стрептавидином. в) Связывание биотинилированного анти-х годовtreptavidin антитела к DyLight 488 стрептавидин. Антитела могут связываться стрептавидин через свои антиген-связывающий участок или могут быть связаны стрептавидин через биотин остатков. г) Усиление сигнала дальнейшего окрашивания флуоресцентным DyLight 488 сопряженное стрептавидином. Рисунок 3. Проточная цитометрия точка делянок вперед по сравнению с боковой разброс результатов) 1 мг / мл лизоцима, 3 мкг / мл протеиназы К пермеабилизации и б) 5 мг / мл лизоцима, 3 мкг / мл протеиназы К пермеабилизации. Рисунок 4. Гистограмма анализ потока МШУ-FISH результаты. Флуоресцентный сигнал, генерируемый из каждого образца показывает четыре следы: черный – р-РНК конкретных МШУ зонд; красный – отрицательный контроль "не выразил р-РНК; синий – отрицательный контроль" нет МШУ; фиолетовый -Отрицательное "нет красителя« контроль.

Discussion

МШУ поток-FISH метод, представленный здесь был использован для обнаружения выражение р-РНК из грамотрицательные бактерии Vibrio морских campbellii экспрессии которых ранее было подтверждено с помощью микрочипов основе профилирования экспрессии и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции ^16. На сегодняшний день мы использовали этот метод для контроля экспрессии различных РНК (например, транс-закодированных Срна, р-РНК, которые модулируют активность белка, riboswitches, и мРНК). Таким образом, мы уверены, что метод является гибкой и может быть использован для обнаружения любых р-РНК, или мРНК цели и могут быть модифицированы для использования в любых видов бактерий или типа клеток. Если модификации этого протокола необходимо для других типов клеток, наиболее важной переменной для рассмотрения манипулирования является пермеабилизации шаг. Например, при изменении пермеабилизации условиях, описанных здесь, изменения в концентрации лизоцима и протеиназы К должны быть проверены. Мы обнаружили, что удвоение илиутроить количество лизоцима и протеиназы К привело к существенным изменениям в потоке МШУ-FISH результаты. Кроме того, при проверке дополнительных условий пермеабилизации, клетки должны быть проанализированы на слипания, потерю клеток, а также получить лучший сигнал фоновой флуоресценции отношение. Степени клеточной слипания могут быть проверены на микроскопией и / или проточной цитометрии. По проточной цитометрии, сотовые сгустки присутствуют в виде хвостов вперед по сравнению стороне диаграммы разброса точек и правильного метода пермеабилизации позволит свести к минимуму это воздействие хвостохранилища. Этот метод также поддается мультиплекс р-РНК обнаружения без существенных изменений в протоколе описаны как дополнительные зонды МШУ помечены других гаптенов, таких как дигоксигенин могут быть добавлены в процессе гибридизации шаг, а затем обнаружить анти-дигоксигенин антитела и вторичные антитела флуорофора сопряжены. В настоящее время единственным ограничением, что мы столкнулись с помощью этого метода является его неспособность генерировать достаточный сигнал от слабо бывшихнажата р-РНК видов и предпринимаются усилия, чтобы определить порог обнаружения (в абсолютных числа копий на клетку).

В целом, МШУ поток-FISH метод дает возможность измерять бактериальной или р-РНК экспрессию мРНК на одном уровне ячейки в высокой пропускной образом, чтобы дать представление о присутствии и относительное обилие видов Срна и степень, в которой ее выражения меняется в популяции.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Applied Biosystems/Ambion	AM9625
Nuclease-free water	Applied Biosystems/Ambion	AM9932	(not DEPC treated)
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15714	Ethanol free
Acetic acid	Acros Organics	327290010
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758	Keep desiccated
Lysozyme	Sigma Aldrich	L2879
Proteinase K (20 mg/mL)	Applied Biosystems/Ambion	AM2546
Formamide	Applied Biosystems/Ambion	AM9342	Deionized, aliquot and freeze
Dextran sulfate MW > 500,000	Sigma Aldrich	D8906	Aliquot 60% solution and freeze
Denhardt’s solution 50X concentrate	Sigma Aldrich	D2532	Aliquot and freeze
Sodium citrate buffer 20X	Applied Biosystems/Ambion	AM9770
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL	Applied Biosystems/Ambion	AM9680	Aliquot and freeze
Yeast tRNA (10 mg/mL)	Life Technologies/Invitrogen	15401-011	Aliquot and freeze
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
5X in situ hybridization blocking solution	Vector Laboratories	MB-1220
DyLight 488 streptavidin	Vector Laboratories	SA-5488-1
Biotinylated anti-streptavidin	Vector Laboratories	BA-0500	Aliquot and freeze