ताला न्यूक्लिक एसिड प्रवाह cytometry प्रतिदीप्ति बगल में (LNA के प्रवाह मछली) संकरण: बैक्टीरियल लघु शाही सेना जांच के लिए विधि

Summary

एक उपन्यास उच्च throughput विधि का वर्णन है कि एकल बैक्टीरियल कोशिकाओं से बंद न्यूक्लिक एसिड जांच और प्रवाह cytometry – प्रतिदीप्ति का उपयोग कर छोटे आरएनए और mRNA अभिव्यक्ति के रिश्तेदार quantitation पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है<em> बगल में</em> संकरण.

Abstract

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination^1,2, cellular identification and gene expression^3,4, monitoring viral multiplication in infected cells⁵, and bacterial community analysis and enumeration⁶.

Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (T_m) of these analogs for natural nucleic acids^7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence^9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes^7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA¹² and viral RNA in mammalian cells⁵.

Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes¹³. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Protocol

1. LNA जांच एवं प्रयोगात्मक डिजाइन डिजाइन LNA जांच कि अपने लिखित sRNA / mRNA की रिवर्स पूरक हैं या उन पर कस्टम डिजाइन www.exiqon.com . यदि कस्टम डिजाइन विकल्प का उपयोग कर, आप अनुक्रम पता है, लेकिन नहीं LNA spiking पैटर्न. एक डीएनए या शाही सेना oligonucleotide परिणाम में प्रत्येक LNA के अवशेषों के बीच की टी मीटर में वृद्धि के अलावा दो और 10 डिग्री सेल्सियस के लिए एक LNA शाही सेना संकरण 14 द्वैध. आदर्श रूप में, डिजाइन LNA जांच लंबाई में 20-25 nucleotides (अब जांच और अधिक synthesize करने के लिए मुश्किल हैं) के बीच हो सकता है और 85-90 के बीच एक टी मीटर ° C शाही सेना के लिए संकरण चाहिए. अनुक्रम डिजाइन करने के बाद, ब्लास्ट उपयोग http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi या अपने स्थानीय डेटाबेस के लिए जांच अनुक्रम की तुलना करने के लिए सुनिश्चित जांच केवल अपने sRNA / ब्याज की mRNA के लिए विशिष्ट है. जब LNA के जांच के आदेश, LNA oligonucleotide के 5 'अंत के लिए एक संशोधन बायोटिन – तेग जोड़ें. biotinylation streptavidin डाई संयुग्म के साथ धुंधला के बाद संकरण के लिए आवश्यक है. यह संभव है 3 से इस संशोधन को जोड़ने के 'अंत यदि आवश्यक है, लेकिन इसके अलावा 5 से' अंत कम खर्चीला है और उच्च पैदावार में परिणाम चाहिए. तीन नकारात्मक नियंत्रण पद्धति में शामिल किया जाना चाहिए: (i) एक 'कोई LNA' नियंत्रण में एक LNA जांच संकरण चरण के दौरान नहीं जोड़ा जाता है, (ii) जो एक 'कोई डाई' नियंत्रण में LNA जांच संकरित है लक्ष्य sRNA लेकिन संकरण घटना फ्लोरोसेंट दाग के अभाव के कारण का पता नहीं है, और (iii) 'गैर व्यक्त sRNA / mRNA' नियंत्रण है कि एक LNA जांच है कि आदेश में एक अस्तित्वहीन या गैर व्यक्त sRNA लक्ष्य का इस्तेमाल गैर विशिष्ट संकरण की निगरानी. विशिष्ट LNA जांच यहाँ sRNA CsrB करने के लिए पूरक है और अनुक्रम 5'-बायोटिन – तेग – gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(LNA monomers मेंपत्र अपरकेस). Lyophilized LNA की प्राप्ति, 50 μg / एमएल और स्टोर करने के लिए nuclease मुफ्त पानी के साथ -20 डिग्री सेल्सियस पर 10-20 μL aliquots में resuspend के बाद समाधान 8% (पीएफए) paraformaldehye, 10% पीबीएस में एसिटिक एसिड: मिक्स 1 एमएल पीएफए ​​32%, 400 μL एसिटिक एसिड, 400 μL 10X पीबीएस, = पीएच 7.4, और 2.2 एमएल पानी nuclease मुक्त. जमी aliquots के लिए, एकल उपयोग aliquots में एसिटिक एसिड के बिना -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है. 60% dextran सल्फेट समाधान: एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब 6.0 छ dextran सल्फेट जोड़ने और 10 एमएल की एक अंतिम मात्रा के लिए पानी जोड़ने. इस मिश्रण को 65 से डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में गर्मी तक dextran सल्फेट भंग कर रहा है (02/01 घंटा) ले सकता है. अतिरिक्त पानी solubilization प्रक्रिया के दौरान जोड़ा जा करने के लिए 10 एमएल मात्रा को बनाए रखने की आवश्यकता हो सकती है. अशेष भाजक 60% dextran सल्फेट समाधान और उपयोग करें जब तक दुकान -20 डिग्री सेल्सियस. 2. नियतन हार्वेस्ट bioluminescent 1×10 8 कोशिकाओं <em> विब्रियो campbellii या आपके बैक्टीरिया और ब्याज की एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में उन्हें हस्तांतरण. कक्षों की यह मात्रा चार प्रवाह मछली नमूने (एक विशिष्ट LNA जांच नमूना और तीन नकारात्मक नियंत्रण) के लिए पर्याप्त सामग्री शुरू प्रदान करता है. अतिरिक्त 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब aliquots अगर अन्य sRNA / mRNA प्रजातियों का परीक्षण करने के लिए होने की जरूरत एकत्र होना चाहिए. गोली पांच मिनट के लिए 2300 XG पर centrifugation द्वारा बैक्टीरियल कोशिकाओं. Pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1X पीबीएस के 400 μL में कोशिकाओं resuspend. इस मिश्रण करने के लिए, एक 8% (पीएफए) paraformaldehye 1X फॉस्फेट और 10% एसिटिक एसिड के 400 μL जोड़ने खारा buffered (1X पीबीएस) समाधान, मिश्रण अच्छी तरह से, और 25 में 10 मिनट के लिए सेते · सी पांच मिनट के बाद एक बार मिश्रण. सभी incubations, जब तक अन्यथा नोट, एक गर्म ट्यूब धारक में प्रदर्शन कर रहे हैं. पीएफए ​​समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए या एसिटिक एसिड के अलावा के बाद जमे हुए aliquots से इस्तेमाल किया. Paraformaldehyde crosslinking लगानेवाला है कि जelps सेल आकारिकी की रक्षा के लिए और intracellular शाही सेना को बनाए रखने. गोली centrifugation द्वारा इस मिश्रण से दो मिनट के लिए 4500 XG में और कोशिकाओं pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटायें. भविष्य के सभी कदम है कि centrifugation की आवश्यकता होती है एक ही सेटिंग्स (7K, 2 मिनट) का उपयोग करना चाहिए. यह महत्वपूर्ण है कि निम्नलिखित centrifugation नोट supernatants pipetting और decanting नहीं हटाया जाना चाहिए. कोशिकाओं को 400 μL 1X पीबीएस के साथ दो बार और धो 400 μL 1X पीबीएस में अंतिम सेल गोली resuspend. कोशिकाओं को अब तय कर रहे हैं और 4 में सात दिनों तक के लिए डिग्री सेल्सियस 400 μL 1X पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है. 3. Diethyl pyrocarbonate उपचार 1X पीबीएस (इस समाधान के 400 μL इतना पैमाने पर परीक्षण किया जा तदनुसार हर नमूने के लिए की जरूरत है) में एक diethyl pyrocarbonate (DEPC) के 0.1% समाधान के 400 μL तैयार. DEPC समाधान एक DEPC स्टॉक से ताजा तैयार रहना चाहिए. DEPC उपचार carbethoxylation द्वारा RNases inactivates और घट जाती हैपृष्ठभूमि संकेत. 0.1% प्रत्येक तय बैक्टीरिया कोशिका नमूना DEPC समाधान के 400 μL जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से pipetting द्वारा. 25 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए इस मिश्रण को सेते हैं. कोशिकाओं को दो बार 400 μL 1X Pbs, गोली कोशिकाओं (7K, 2 मिनट) के साथ और सतह पर तैरनेवाला धो हटायें. 4. Permeabilization 1 एमएल Tris EDTA बफर (10 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA, पीएच 8.0) के लिए एक 1.0 मिलीग्राम / एमएल समाधान के लिए lysozyme के 1.0 मिलीग्राम जोड़ें. यह समाधान ताजा तैयार रहना चाहिए. 25 में से 1 मिलीग्राम / एमएल lysozyme कोशिकाओं को हल 800 μL, pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से और सेते जोड़ें ° सी सामयिक मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए. गोली कोशिकाओं (7K, 2 मिनट) और सतह पर तैरनेवाला हटायें. Lysozyme बैक्टीरिया कोशिका दीवारों में पेप्टिडोग्लाइकन वर्तमान hydrolyzing द्वारा एक permeabilization अभिकर्मक के रूप में कार्य करता है. ते बफर में 3.0 proteinase कश्मीर के समाधान μg / एमएल तैयार. यह समाधान एक 20 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर स्टॉक है कि -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है से ताजा तैयार करना चाहिएProteinase कश्मीर एक सेरीन protease है कि प्रोटीन की एक किस्म हज़म और शाही सेना के लिए जांच और अभिकर्मकों की पहुंच में मदद करता है. 3.0 μg / एमएल proteinase कश्मीर सेल गोली के समाधान के 800 μL जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से pipetting द्वारा. ऊष्मायन के माध्यम से आधे रास्ते vortexing के साथ 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. गोली कोशिकाओं (7K, 2 मिनट), सतह पर तैरनेवाला हटाने और कोशिकाओं 400 μL 1X पीबीएस के साथ एक बार धोने. धोने सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद, 400 μL 1X पीबीएस में कोशिकाओं resuspend और resuspension के चार नए 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में 100 μL जोड़ने. गोली कोशिकाओं (7K, 2 मिनट) और सतह पर तैरनेवाला हटायें. 5. संकरण प्रत्येक नमूने के लिए संकरण बफर (एचबी) की 100 μL तैयार. एचबी 50% formamide की मात्रा 10% जन द्वारा dextran सल्फेट (हर 100 μL के लिए 60% dextran सल्फेट समाधान के 16.7 μL जोड़ने), 1X Denhardt समाधान, 50 मिमी सोडियम फास्फेट पीएच 7.0 से बना है,2X सोडियम साइट्रेट (एसएससी), sheared सामन शुक्राणु डीएनए (SSSD) और 20 μg खमीर tRNA के 20 μg. एचबी के घटकों में से प्रत्येक एक अलग उद्देश्य है. Formamide न्यूक्लिक एसिड duplexes जिससे शाही सेना के विकृतीकरण और कोशिका क्षति को न्यूनतम करने के साथ मदद करने के पिघलने के तापमान को कम करती है. Dextran सल्फेट एक मात्रा को छोड़कर बहुलक जांच ध्यान केंद्रित करने के लिए और संकरण दर में वृद्धि के रूप में प्रयोग किया जाता है. Denhardts समाधान, खमीर tRNA और SSSD एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में सेवा करने के लिए गैर – विशिष्ट बंधनकारी कम. Resuspension युक्त 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों सेल के प्रत्येक में 95 μL एचबी और sRNA / 5.0 μL जोड़ने mRNA विशिष्ट LNA या पानी (कोई LNA नकारात्मक नियंत्रण के लिए) [विशिष्ट LNA अंतिम एकाग्रता की 20 pmol]. उदाहरण के लिए: ट्यूब 1 – 95 μL एचबी + 5.0 μL sRNA / mRNA विशेष जांच एचबी 2 ट्यूब – 95 μL + 5.0 μL / sRNA mRNA विशेष जांच ('कोई डाई' नकारात्मक नियंत्रण) 3 ट्यूब – 95 μL एचबी + 5.0 μL sRNA/ MRNA जांच ('गैर व्यक्त sRNA /' नकारात्मक नियंत्रण mRNA) 4 ट्यूब – 95 μL एचबी + 5.0 μL पानी ('कोई LNA के' नकारात्मक नियंत्रण) 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सभी चार नमूनों सेते हैं. संकरण तापमान LNA जांच (s) टी मीटर पर निर्भर करता है और लगभग 30 पर सेट किया जाना चाहिए ° सी नीचे annealing शाही सेना के लिए टी मीटर भविष्यवाणी . दोनों ऊंचा संकरण और एचबी में तापमान formamide sRNA या ब्याज की mRNA के माध्यमिक संरचना के विकृतीकरण सुनिश्चित करता है. 6. डाक – संकरण washes संकरण के बाद 0.1% के बीच 20 (SSCT) के साथ 1.0 एमएल 0.1X एसएससी संकरण मिश्रण को जोड़ने. यह कोशिकाओं चिपचिपा संकरण समाधान से हटाया जा करने की अनुमति आवश्यक है. गोली कोशिकाओं (7K, 2 मिनट) और सतह पर तैरनेवाला हटायें. 50% formamide के 200 μL, 2X एसएससी, 0.1% जोड़ें के बीच-20 सेल छर्रों के लिए, मिश्रण अच्छी तरह से और incub65 में ° एक हीटिंग ब्लॉक सी 30 मिनट के लिए खा लिया. मिश्रण, गोली कोशिकाओं (7K, 2 मिनट) के लिए 1 एमएल 0.1X SSCT जोड़ें और सतह पर तैरनेवाला हटायें. 500 μL 0.1X SSCT जोड़ें कोशिकाओं resuspend और एक गर्मी ब्लॉक में 65 में 40 मिनट ° सी के लिए सेते हैं. गोली कोशिकाओं (7K, 2 मिनट) और सतह पर तैरनेवाला हटायें. 7. अवरुद्ध और धुंधला हो जाना अवरुद्ध (बी बी) बफर और धुंधला streptavidin डाई समाधान तैयार करें. एक 5X शेयर (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, अभिकर्मकों देखें) से एक 1X बी.बी. समाधान तैयार करें. चार ट्यूबों के प्रत्येक सेट के लिए, 1.2 एमएल 1X बी.बी. तैयार करते हैं. सेल छर्रों, resuspend 200 μL बी.बी. 1X जोड़ें और 25 में 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस एक streptavidin संयुग्मित डाई biotinylated LNA जांच का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. जबकि अवरुद्ध, 2 μg / एमएल DyLight 488 streptavidin या अपने वांछित 1X बी बी में 30 मिनट (तीन नमूने के लिए, 300 μL) के लिए डाई streptavidin संयुग्म के समाधान तैयार है. Incub बाद1X, बी बी कोशिकाओं गोली (7K, 2 मिनट) और सतह पर तैरनेवाला हटायें के साथ व्यावहारिक. Streptavidin डाई सेल छर्रों के समाधान के 50 μL जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से, और 25 में 12 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस एक भंवर या thermomixer में लगातार मिश्रण के साथ. 'कोई डाई' नियंत्रण के लिए, केवल 50 μL 1X अवरुद्ध बफर जोड़ें. प्रोटोकॉल के बाकी के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से ट्यूब की रक्षा करना. कोशिकाओं 500 μL 0.1X SSCT बफर के साथ एक बार धोने और एक बार 400 μL 1X पीबीएस के साथ साथ 0.1% के बीच 20 (PBST). गोली कोशिकाओं (7K, 2 मिनट) और सतह पर तैरनेवाला हटायें. प्रारंभिक धुंधला streptavidin-संयुग्म के बाद संकेत streptavidin – डाई संयुग्म biotinylated विरोधी streptavidin एंटीबॉडी शुरू और फिर इस तरह streptavidin डाई संकरित LNA जांच के प्रति संकेत उत्पादन में वृद्धि (चित्रा 2) के साथ एक दूसरी बार धुंधला से परिलक्षित होता है . 1 μg / एमएल के 100 μL जोड़ें 1X Pbs, resuspen में विरोधी streptavidin एंटीबॉडी biotinylatedघ कोशिकाओं, और 25 में सेते ° C सामयिक मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए. गोली कोशिकाओं (7K, 2 मिनट), सतह पर तैरनेवाला हटाने और 400 μL 1X PBST के साथ दो बार धोने. 2 μg / एमएल streptavidin डाई कोशिकाओं को हल के 50 μL जोड़ें मिश्रण अच्छी तरह से, और 25 में 12 मिनट के लिए सेते ° सी एक भंवर या thermomixer में लगातार मिश्रण के साथ. 'कोई डाई' नियंत्रण के लिए, केवल 50 μL 1X अवरुद्ध बफर जोड़ें. कोशिकाओं को 500 μL 0.1X SSCT बफर के साथ एक बार और एक बार के साथ 400 μL 1X PBST धो. 200 μL 1X और 4 पर PBST दुकान में कोशिकाओं Resuspend डिग्री सेल्सियस तक प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए तैयार है. छोटे बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए प्रवाह करने के लिए मूल आकार में कमी की धीमी दर निर्धारित किया है. इसके अलावा, आगे तितर बितर दहलीज cutoffs के साथ प्रवाह cytometers के लिए, cutoff कम के रूप में संभव के रूप में में सेट किया जाना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित छोटे बैक्टीरियल कोशिकाओं का पता चला रहे हैं. DyLight 488 का पता लगाने के लिए, प्रवाह कोशिकामापी एक 488 एनएम लेजर और मानक उत्सर्जन के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिएFITC के लिए फिल्टर. 2×10 कम से कम चार घटनाओं को एकत्र किया जाना चाहिए . प्रवाह cytometers अलग लेज़रों के साथ सुसज्जित के साथ संगतता के लिए, अन्य streptavidin संयुग्मित fluorophores इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 8. प्रतिनिधि परिणाम कोशिकाओं का एक उदाहरण है कि तय कर रहे हैं प्रभावी ढंग से permeabilized चित्रा 3A में प्रवाह cytometry डॉट साजिश में दिखाया गया है . जब permeabilization के लिए ऊपर वर्णित शर्तों का उपयोग कर, सेल जनसंख्या छोटे और समरूप संकेत कुछ सेल समुच्चय है. जब lysozyme के उच्च सांद्रता (5 मिलीग्राम / एमएल) का उपयोग किया जाता है, कोशिकाओं को और अधिक कुल के लिए की संभावना है और आगे बढ़ स्कैटर मूल्यों, बड़े कणों (3B चित्रा) के संकेत दिखा . एक सफल LNA के प्रवाह मछली प्रयोग से प्रवाह cytometry डेटा के एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. हिस्टोग्राम तीन नकारात्मक नियंत्रण के साथ साथ एक लक्ष्य sRNA की विशिष्ट पहचान को दर्शाता है.'कोई डाई' नकारात्मक नियंत्रण कम प्रतिदीप्ति, 'कोई LNA' और 'गैर व्यक्त sRNA' नकारात्मक नियंत्रण द्वारा पीछा पैदा करता है. अंत में, sRNA विशेष LNA जांच के साथ नमूना सबसे बड़ा प्रतिदीप्ति उत्पादन. एक बार विधि और LNA जांच इस तरह से मान्य हैं, अतिरिक्त प्रयोगों sRNA संकेत में समय पर परिवर्तन की निगरानी के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है परिवर्तन या विविध संस्कृति शर्तों, आदि के जवाब में, चित्रा 1 बैक्टीरियल sRNA का पता लगाने के के लिए एक LNA के प्रयोग प्रवाह मछली की समग्र योजना का चित्रण . चित्रा 2 धुंधला और LNA के संकेत प्रवाह मछली के प्रवर्धन. biotinylated LNA जांच के संकरण). ख) फ्लोरोसेंट DyLight 488 streptavidin संयुग्म के साथ धुंधला. ग) biotinylated विरोधी के बंधनDyLight 488 streptavidin treptavidin एंटीबॉडी. एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी साइट के माध्यम से streptavidin बाँध या streptavidin द्वारा अपने बायोटिन अवशेषों के माध्यम से बाध्य कर सकते हैं किया जा सकता है. घ) फ्लोरोसेंट DyLight 488 streptavidin संयुग्म के साथ आगे धुंधला द्वारा संकेत प्रवर्धन. चित्रा 3. प्रवाह cytometry डॉट बनाम ओर एक) 1 मिलीग्राम / एमएल lysozyme, 3 μg / एमएल proteinase कश्मीर permeabilization और ख) 5 lysozyme मिलीग्राम / एमएल, 3 / μg मिलीलीटर proteinase कश्मीर permeabilization के लिए तितर बितर परिणाम आगे दिखा भूखंडों . चित्रा 4 LNA के प्रवाह मछली परिणामों के हिस्टोग्राम विश्लेषण. फ्लोरोसेंट प्रत्येक नमूने से उत्पन्न संकेत चार निशान के द्वारा दिखाया गया है: काले – sRNA विशेष LNA जांच, लाल – 'गैर व्यक्त sRNA' नकारात्मक नियंत्रण, नीले – 'कोई LNA के' नकारात्मक नियंत्रण, बैंगनी -'कोई डाई' नकारात्मक नियंत्रण.

Discussion

LNA के प्रवाह मछली विधि यहाँ प्रस्तुत करने के लिए ग्राम नकारात्मक समुद्री जीवाणु विब्रियो campbellii जिनकी अभिव्यक्ति पहले माइक्रोएरे आधारित अभिव्यक्ति की रूपरेखा और रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ ^चेन प्रतिक्रिया 16 के माध्यम से पुष्टि की गई है से एक sRNA की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. तिथि करने के लिए, हम इस पद्धति का इस्तेमाल किया है (जैसे पार इनकोडिंग sRNA, sRNA है कि प्रोटीन की गतिविधि, riboswitches, और mRNA मिलाना) RNAs के एक किस्म की अभिव्यक्ति की निगरानी. जैसे, हम विश्वास है कि विधि अनुकूलनीय है और किसी भी sRNA mRNA या लक्ष्य का पता लगाने और किसी भी बैक्टीरियल प्रजातियों या सेल प्रकार में उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता इस्तेमाल किया जा सकता हैं. यदि इस प्रोटोकॉल के संशोधन के अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए आवश्यक है, सबसे महत्वपूर्ण चर करने के लिए छेड़खानी पर विचार permeabilization कदम है. उदाहरण के लिए, जब permeabilization यहाँ वर्णित शर्तों को संशोधित, lysozyme proteinase और कश्मीर की सांद्रता में परिवर्तन का परीक्षण किया जाना चाहिए. हम जानते हैं कि दोहरीकरण या पायाlysozyme proteinase और कश्मीर की राशि तीन गुना LNA के प्रवाह मछली परिणामों में प्रमुख परिवर्तन के परिणामस्वरूप. इसके अलावा, जब अतिरिक्त permeabilization शर्तों परीक्षण, कोशिकाओं clumping, सेल, हानि, और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति अनुपात करने के लिए सबसे अच्छा प्राप्य संकेत करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए. सेल clumping की हद माइक्रोस्कोपी और / या प्रवाह cytometry द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. प्रवाह cytometry करके, सेल clumps मौजूद है के रूप में एक आगे की ओर तितर बितर डॉट साजिश और सही permeabilization विधि बनाम में पूंछ इस पीछा प्रभाव को कम करेगा. इस विधि भी मल्टीप्लेक्स में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए प्रमुख संशोधनों के बिना sRNA पता लगाने के लिए उत्तरदायी है के रूप में अतिरिक्त LNA digoxigenin जैसे अन्य haptens के साथ लेबल जांच संकरण चरण के दौरान जोड़ा जा सकता है और फिर एक एंटीबॉडी विरोधी और माध्यमिक एंटीबॉडी fluorophore संयुग्म digoxigenin के साथ पकड़ा. वर्तमान में, केवल सीमा है कि हम इस विधि के साथ सामना करना पड़ा है अपनी दुर्बलता से पूर्व से पर्याप्त संकेत उत्पन्न असमर्थता हैदबाया sRNA प्रजातियों और प्रयासों का पता लगाने दहलीज (सेल प्रति निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या में) निर्धारित करने के लिए चल रहे हैं.

कुल मिलाकर, LNA विधि प्रवाह मछली के लिए एक उच्च throughput उपस्थिति और एक sRNA प्रजातियों के रिश्तेदार बहुतायत और डिग्री है जो अपनी अभिव्यक्ति बदलता है पर अंतर्दृष्टि प्रदान करने के तरीके में एकल सेल स्तर पर उपाय बैक्टीरियल sRNA या mRNA अभिव्यक्ति का अवसर प्रदान करता है एक जनसंख्या में.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Applied Biosystems/Ambion	AM9625
Nuclease-free water	Applied Biosystems/Ambion	AM9932	(not DEPC treated)
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15714	Ethanol free
Acetic acid	Acros Organics	327290010
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758	Keep desiccated
Lysozyme	Sigma Aldrich	L2879
Proteinase K (20 mg/mL)	Applied Biosystems/Ambion	AM2546
Formamide	Applied Biosystems/Ambion	AM9342	Deionized, aliquot and freeze
Dextran sulfate MW > 500,000	Sigma Aldrich	D8906	Aliquot 60% solution and freeze
Denhardt’s solution 50X concentrate	Sigma Aldrich	D2532	Aliquot and freeze
Sodium citrate buffer 20X	Applied Biosystems/Ambion	AM9770
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL	Applied Biosystems/Ambion	AM9680	Aliquot and freeze
Yeast tRNA (10 mg/mL)	Life Technologies/Invitrogen	15401-011	Aliquot and freeze
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
5X in situ hybridization blocking solution	Vector Laboratories	MB-1220
DyLight 488 streptavidin	Vector Laboratories	SA-5488-1
Biotinylated anti-streptavidin	Vector Laboratories	BA-0500	Aliquot and freeze