מיים מודלים של הדמיה חיה של תאים 4D גידול: אינטראקציות microenvironment המשפיעים ממאירה התקדמות
Summary
פיתחנו מודלים coculture 3D הדמיה חיה תאים בזמן אמת של אינטראקציות בין תאים סרטניים בשד ותאים אחרים microenvironment שלהם המשפיעים על התפתחות פנוטיפ פולשני. מודלים אלה יכולים לשמש מסכי פרה עבור תרופות למיקוד paracrine המושרה, פרוטאוליטים chemokine / ציטוקינים ו קינאז מסלולים מעורבים הפולשנות.
Abstract
פיתחנו מודלים coculture 3D, אשר אנו מיים טווח (מ 'ammary rchitecture ו-M ngineering icroenvironment ה), והשתמשו בהם הדמיה חיה תאים בזמן אמת של התא: אינטראקציות התא. המטרה הכללית שלנו היתה לפתח דגמים לשחזר את הארכיטקטורה של נגעים השד preinvasive ללמוד ההתקדמות שלהם פנוטיפ פולשני. באופן ספציפי, פיתחנו מודלים לניתוח אינטראקציות בין טרום ממאירים בשד האפיתל גרסאות סלולריים סוגי תאים אחרים של microenvironment הגידול כי היו מעורבים שיפור או לצמצם את ההתקדמות של תאים בשד preinvasive אפיתל ל קרצינומות ductal פולשנית. סוגי תאים אחרים שנחקרו עד כה הם תאים myoepithelial, fibroblasts, מקרופאגים דם כלי הדם הלימפה ותאי האנדותל. בנוסף הדגמים מיים, אשר נועדו לשחזר את אינטראקציות הסלולר בתוך השד במהלךהתקדמות סרטן, פיתחנו מודלים דומים להתפתחות של סרטן הערמונית.
כאן אנו מדגימים את ההליכים להקמת cocultures 3D יחד עם שימוש בהדמיה חי תאים ו assay proteolysis תפקודית לבצע את המעבר של cocultures של סרטן השד ductal באתרם (DCIS) תאים פיברובלסטים, פנוטיפ פולשני לאורך זמן, במקרה זה על פני עשרים ושלושה ימים בתרבות. Cocultures מיים כוללים מספר רב של שכבות. Fibroblasts המוטבעים השכבה התחתונה של סוג אני קולגן. על הממוקם שכבה של קרום במרתף המחודשת (RBM) שבו תאים DCIS הם זרע. השכבה העליונה הסופי של RBM 2% כלול מתחדש עם כל שינוי של התקשורת. כדי proteolysis התמונה שמראה את ההתקדמות כדי פנוטיפ פולשני, אנו משתמשים צבען הרווה (DQ) חלבוני ניאון מטריקס (DQ-קולגן ערבבתי עם שכבת קולגן I ו-DQ קולגן IV מעורבב עם השכבה האמצעית של RBז) ולבחון תרבויות חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal. חלקים אופטיים נלכדים, עיבוד מחדש ב-3D עם תוכנת ויזואליזציה Volocity. במשך 23 ימים מיים cocultures, התאים מתרבים DCIS ו להתמזג לתוך מבנים גדולים פולשניים. Fibroblasts להעביר ו המוטמעים מבנים אלה פולשניים. שברי פרוטאוליטים הניאון של collagens נמצאות בקשר עם השטח של מבנים DCIS, intracellularly, והתפזרו ברחבי גם מטריקס שמסביב. תרופות פרוטאוליטים היעד, chemokine / ציטוקינים ו קינאז מסלולים או שינויים בהרכב הסלולר של cocultures יכול להפחית את הפולשנות, טוען כי מודלים מיים יכול לשמש מסכי פרה של גישות טיפוליות חדשות.
Protocol
Discussion
כפי שתואר, cocultures מיים יכול לשמש הדמיה חיה תאים בזמן אמת של אינטראקציות בין המרכיבים הסלולר השונות המרכיבות הגידול השד microenvironment שלה. בשנת הלימודים השוטפת במעבדה שלנו, השתמשנו מיים cocultures לזהות מסלולים פרוטאוליטים הקשורים המעבר DCIS כדי קרצינומה ductal פולשנית, כמו גם את הא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 CA131990 (BFS ו RRM). חי תאים הדמיה בוצעה Core משאבים, מיקרוסקופיה הדמיה Cytometry נתמך, בין השאר, על ידי NIH מרכז מענק p30 CA22453 כדי סרטן Karmanos המכון, וויין סטייט ועל ידי אגף המחקר Perinatology של המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות , וויין סטייט.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) |
Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-col IV D12052 |
|
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific Co. | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza | MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 |
Phenol red–free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
