Mame Modeller for 4D Live-celle Imaging av tumor: mikromiljøet interaksjoner som Impact Ondartet Progresjon
Summary
Vi har utviklet 3D coculture modeller for levende celle bildebehandling i sanntid av interaksjoner mellom bryst tumorceller og andre celler i mikromiljøet deres som påvirker progresjon til en invasiv fenotype. Disse modellene kan tjene som prekliniske skjermer for narkotika å målrette parakrine-indusert proteolytiske og chemokine / cytokin og kinase stier involvert i invasivitet.
Abstract
Vi har utviklet 3D coculture modeller, som vi kaller MAME (m ammary en rchitecture og m icroenvironment e ngineering), og brukte dem til live-celle bildebehandling i sanntid av celle: celle interaksjoner. Vårt overordnede mål var å utvikle modeller som rekapitulere arkitekturen av preinvasive bryst lesjoner å studere deres progresjon til en invasiv fenotype. Konkret har vi utviklet modeller for å analysere samspill mellom pre-maligne bryst epiteliale celler varianter og andre celletyper av svulsten mikromiljøet som har vært innblandet i styrke eller redusere progresjon av preinvasive bryst epitelceller til invasive duktale karsinomer. Andre celletyper studert hittil er korgcellene, fibroblaster og makrofager og blod og lymfatiske mikrovaskulære endotelceller. I tillegg til Mame modellene som er utviklet for å rekapitulere de cellulære interaksjoner i brystet underkreft progresjon, har vi utviklet sammenlignbare modeller for utviklingen av prostatakreft.
Her har vi illustrere prosedyrene for å etablere 3D cocultures sammen med bruk av live-celle bildebehandling og en funksjonell proteolyse analysen å følge overgangen cocultures av brystkreft duktalt carcinoma in situ (DCIS) celler og fibroblaster til en invasiv fenotype over tid, i dette tilfellet over tjue-tre dager i kultur. Den MAME cocultures består av flere lag. Fibroblaster er innebygd i bunnlaget av type I kollagen. På den er plassert et lag av rekonstituert basalmembran (RBM) som DCIS celler blir seedet. En endelig øverste laget av 2% RBM er inkludert og fylles med hver endring av media. Slik image proteolyse tilknyttet progresjon til en invasiv fenotype, bruker vi dye-let (DQ) fluorescerende matrix proteiner (DQ-collagen jeg blandet med lag av kollagen I og DQ-kollagen IV blandet med midten laget av RBM) og observere levende kulturer bruker konfokalmikroskopi. Optiske seksjoner er fanget, behandlet og rekonstruert i 3D med Volocity visualisering programvare. I løpet av 23 dager i MAME cocultures, de DCIS cellene sprer og coalesce i store invasive strukturer. Fibroblaster migrerer og blir innlemmet i disse invasive strukturer. Fluorescent proteolytiske fragmenter av bindevevet er funnet i sammenheng med overflaten av DCIS strukturer, intracellulært, og også spredt over hele den omkringliggende matrise. Legemidler som mål proteolytisk, chemokine / cytokin og kinase pathways eller modifikasjoner i mobilnettet sammensetningen av cocultures kan redusere invasivitet, som tyder på at Mame modellene kan brukes som prekliniske skjermer for nye terapeutiske tilnærminger.
Protocol
Discussion
Som vist, kan det MAME cocultures brukes til live-celle bildebehandling i sanntid av interaksjoner mellom de ulike cellulære bestanddeler som utgjør en brystsvulst og dens mikromiljøet. I pågående studier i laboratoriet vårt, har vi brukt MAME cocultures å identifisere proteolytiske veier i forbindelse med overgang fra DCIS til invasivt duktalt karsinom, samt interaksjoner mellom proteolytiske stier og andre veier som er involvert i denne overgangen som chemokine / cytokin / vekstfaktor veier . Vi videre viste at…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet, delvis ved National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS og RRM). Live-celle bildebehandling ble utført i Mikroskopi, Imaging og cytometri Resources Core-støtte, delvis ved NIH Senter bevilgning P30 CA22453 til Karmanos Cancer Institute, Wayne State University og ved Perinatology Forskning Branch av National Institutes of Child Health and Development , Wayne State University.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) |
Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-col IV D12052 |
|
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific Co. | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza | MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 |
Phenol red–free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
