Probenvorbereitung von<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies
Summary
Die metabolomische Profil<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Wird nach Wachstum in Bouillon-Kulturen bestimmt. Bedingungen können variiert werden, um die Wirkungen von Nahrungsergänzungsmitteln, Oxidantien und Anti-Tuberkulose-Mittel auf das metabolische Profil von diesem Mikroorganismus getestet werden. Verfahren für Extraktzubereitung gilt sowohl für 1D<sup> 1</sup> H und 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> C-NMR-Analysen.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis ist eine der Hauptursachen der Sterblichkeit des Menschen auf einer globalen Skala. Die Entstehung der beiden Multi-(MDR) und extensiv-(XDR) resistente Stämme droht aktuellen Seuchenbekämpfung Bemühungen entgleisen. So gibt es ein dringender Bedarf an Medikamenten und Impfstoffen, die wirksamer als die gegenwärtig verfügbar sind zu entwickeln. Das Genom von M. Tuberkulose ist seit mehr als 10 Jahren bekannt, doch gibt es erhebliche Lücken in unserem Wissen von Genfunktionen und Wesentlichkeit. Viele Studien haben seit Genexpressionsanalyse an beiden transkriptomischen und Proteomik-Ebenen verwendet werden, um die Auswirkungen von Medikamenten, Oxidantien und Wachstumsbedingungen in globalen Muster der Genexpression zu bestimmen. Letztlich wird die endgültige Antwort dieser Veränderungen in der Zusammensetzung des metabolischen Bakterium einschließlich einiger tausend kleinem Molekulargewicht Chemikalien reflektiert. Vergleicht man die metabolische Profile von Wildtyp-und mutierten Stämmen, entweder unbehandelt oder treated mit einem bestimmten Wirkstoff, kann effektiv ermöglichen Zielidentifikation und kann zur Entwicklung von neuartigen Inhibitoren mit Anti-Tuberkulose-Aktivität führen. Ebenso können die Wirkungen von zwei oder mehreren Bedingungen auf der Metabolom ebenfalls bewertet werden. Kernspinresonanz (NMR) ist eine leistungsstarke Technologie, die zur Identifizierung und Quantifizierung von Stoffwechsel-Zwischenprodukte wird. Bei diesem Protokoll, Verfahren zur Herstellung von M. Tuberkulose Zellextrakten für NMR metabolomische Analyse beschrieben. Zellkulturen werden unter geeigneten Bedingungen und erforderlichen Biosicherheitsstufe 3 Containment, 1 geerntet gewachsen, und mechanischen Lyse unter Beibehaltung Kälte zur Konservierung von Metaboliten zu maximieren. Zelllysaten gewonnen werden, gefiltert sterilisiert, und bei extrem niedrigen Temperaturen. Aliquots von diesen Zellextrakte auf Middlebrook 7H9 Agar für koloniebildenden Einheiten der Abwesenheit von lebensfähigen Zellen zu überprüfen ausplattiert. Nach zwei Monaten Inkubation bei 37 ° C, wenn kein viLage Kolonien beobachtet werden, werden Proben aus dem Containment Anlage zur Weiterverarbeitung entfernt. Extrakte werden lyophilisiert, erneut in deuteriertem Puffer und injiziert in der NMR-Gerät, Erfassen spektroskopischer Daten, die anschließend einer statistischen Analyse unterzogen wird. Die beschriebenen Verfahren können sowohl für eindimensionale (1D) 1 H-NMR-und zweidimensionaler (2D) 1 H-13 C-NMR-Analysen angewandt werden. Diese Methode liefert zuverlässigere geringem Molekulargewicht Identifizierung von Metaboliten und mehr zuverlässige und empfindliche quantitative Analysen der Zellextrakt metabolische Zusammensetzungen als chromatographischen Methoden. Variationen der beschriebenen Verfahren nach der Zelllyse Schritt kann auch für parallele Proteomanalyse angepasst werden.
Protocol
Discussion
Eine beträchtliche Anzahl von Studien haben die Transkriptom-und Proteom-Profile von M. analysiert Tuberkulose unter einer Vielzahl von in vitro und in vivo-Bedingungen. 11-16 Letztlich Veränderungen in der Genexpression und Enzymaktivität von Variationen in den Konzentrationen der niedermolekulare Moleküle führen. Die vollständige Beschreibung dieser Verbindungen bildet den Metabolom. So können die Auswirkungen von Drogen und unterschiedlichen Wachstumsbedingungen a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich bei allen Mitgliedern des Labors von Dr. Barletta und Dr. Powers für hilfreiche Kommentare bei der Entwicklung des Protokolls. Wir danken Wendy Austin für hilfreiche Diskussionen und Korrekturlesen des Manuskripts. Die Arbeit in diesem Manuskript beschrieben wurde durch Samen Pilotbeihilfen jeder Ermittler oben von der University of Nebraska-Lincoln Redox Biology Center (parent Grant # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI) aufgeführt finanziert. Darüber hinaus danken wir Dr. Ofelia Chacon für die Bereitstellung von Mitteln aus ihrem R21 Zuschuss (1R21AI087561-01A1) für Forschung Lieferungen und Mr. Halouska partielle Gehalts Unterstützung NMR-Techniken in dieser Veröffentlichung enthaltenen standardisieren.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| ADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| BACS-120 Sample Changer | Bruker | ||
| Bruker Avance NMR | Bruker | 500 MHz | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Fraction V |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | Benchtop |
| Centrifuge Tubes | Corning | 430291 | 50 ml sterile polypropylene |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | 2.0 ml sterile polypropylene |
| Cycloheximide | A.G. Scientific | C-1189 | Toxic |
| D(+) – Glucose | ACROS | 41095-0010 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385 | |
| Erlenmeyer Flask | VWR | 89095-266 | Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap |
| Flash Freeze Flask | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| Freeze Dryer | VWR | 82019-038 | 4.5 L Benchtop |
| Glycerol | GibcoBRL | 15514-029 | |
| Incubator | New Brunswick | Innova 40 | Benchtop shaker |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911-100 | |
| Lysis Machine | MP Biomedicals | FastPrep-24 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | Benchtop |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | Benchtop |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco | 271310 | |
| NMR tubes | Norell | ST500-7 | 5mM |
| OADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| Oleic Acid | Sigma | O1008 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR | BDH0266 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | BDH0268 | |
| Rotor – Microfuge 22R | Beckman Coulter | F241.5P | Sealed and polypropylene |
| Rotor – Allegra X-15R | Beckman Coulter | SX4750 | With bio-certified covers |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 | Cambridge Isotope | DLM-48 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU-530 | |
| Spectrophotometer Cuvettes | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides |
| Syringe | Becton Dickinson | 309585 | Sterile, 3 ml Luer-Lok |
| Syringe Filter | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm sterile cellulose acetate |
| Tween 80 | Fisher Scientific | BP338-500 |
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