Préparation de l'échantillon de<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Extraits pour Magnétique Nucléaire études métabolomiques résonance
Summary
Le profil métabolomique des<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Est déterminé après la croissance dans les bouillons de culture. Les conditions peuvent être modifiées pour tester les effets des suppléments nutritionnels, des oxydants et des agents anti-tuberculeux sur le profil métabolique de ce micro-organisme. Procédure de préparation d'extrait est applicable à la fois pour 1D<sup> 1</sup> H et 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> C analyses RMN.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis est une cause majeure de mortalité chez les êtres humains à l'échelle mondiale. L'émergence de deux multi-(MDR) et ultra-(XDR) souches résistantes aux médicaments menace de faire dérailler les efforts actuels de lutte contre les maladies. Ainsi, il ya un besoin urgent de développer des médicaments et des vaccins qui sont plus efficaces que ceux actuellement disponibles. Le génome de M. la tuberculose est connue depuis plus de 10 ans, mais il ya d'importantes lacunes dans notre connaissance de la fonction des gènes et l'essentialité. De nombreuses études ont depuis utilisé l'analyse de l'expression des gènes, tant au niveau transcriptomique et protéomique afin de déterminer les effets des médicaments, des oxydants et des conditions de croissance sur les tendances mondiales de l'expression des gènes. En fin de compte, la réponse définitive de ces modifications est reflétée dans la composition métabolique de la bactérie, y compris quelques milliers de petits produits chimiques de poids moléculaire. En comparant les profils métaboliques de type sauvage et des souches mutantes, non traitées ou treated à un médicament particulier, peut effectivement permettre l'identification des cibles et peut conduire au développement de nouveaux inhibiteurs des anti-tuberculeux activité. De même, les effets de deux ou plusieurs conditions sur le métabolome peut également être évaluée. La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technologie puissante qui est utilisée pour identifier et quantifier les intermédiaires métaboliques. Dans ce protocole, les procédures pour la préparation de M. extraits cellulaires tuberculose pour la RMN métabolomique analyse sont décrites. Des cultures de cellules sont cultivées dans des conditions appropriées et de biosécurité de niveau requis de confinement 3, 1 récoltées et soumises à une lyse mécanique, tout en maintenant le froid pour optimiser la préservation de métabolites. Les lysats cellulaires sont récupérés, filtrés stérilisés et stockés à des températures ultra basses. Des aliquotes de ces extraits de cellules sont étalées sur gélose Middlebrook 7H9 pour unités formant colonies pour vérifier l'absence de cellules viables. Après deux mois d'incubation à 37 ° C, en l'absence de vicolonies capables sont observées, les échantillons sont retirés de la zone de confinement pour le traitement en aval. Extraits sont lyophilisées, resuspendues dans un tampon deutéré et injecté dans l'appareil RMN, la saisie des données spectroscopiques qui est ensuite soumis à une analyse statistique. Les procédures décrites peuvent être appliquées à la fois à une dimension (1D) RMN 1 H et en deux dimensions (2D) 1 H-13 C analyses RMN. Cette méthodologie fournit plus fiable d'identification petit poids moléculaire et plus métabolite fiables et sensibles des analyses quantitatives des compositions extrait métaboliques cellulaires que les méthodes chromatographiques. Variations de la procédure décrite à la suite de l'étape de lyse cellulaire peut également être adapté pour l'analyse protéomique parallèle.
Protocol
Discussion
Un nombre important d'études ont analysé les profils transcriptomiques et protéomiques de M. la tuberculose sous une variété de tests in vitro et in vivo. 11-16 En fin de compte, les changements dans l'expression des gènes et l'activité enzymatique conduire à des variations dans les concentrations de petites molécules de poids moléculaire. La description complète de ces composés constitue le métabolome. Ainsi, les effets des drogues et des condition…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier tous les membres des laboratoires du Dr Barletta et le Dr Powers pour leurs commentaires utiles tout en développant le protocole. Nous tenons à remercier Wendy Austin pour des discussions utiles et relecture du manuscrit. Les travaux décrits dans ce manuscrit a été financée par des subventions pilotes de semences à chaque enquêteur énumérés ci-dessus, de l'Université de Nebraska-Lincoln Center Biologie Redox (parent subvention no 017675 NCRR 2P20RR, D. Becker, PI). En outre, nous tenons à remercier le Dr Ofelia Chacon pour fournir des fonds de son subvention R21 (1R21AI087561-01A1) pour les fournitures de recherche et de soutien M. Halouska de salaire partiel de standardiser les techniques de RMN inclus dans cette publication.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| ADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| BACS-120 Sample Changer | Bruker | ||
| Bruker Avance NMR | Bruker | 500 MHz | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Fraction V |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | Benchtop |
| Centrifuge Tubes | Corning | 430291 | 50 ml sterile polypropylene |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | 2.0 ml sterile polypropylene |
| Cycloheximide | A.G. Scientific | C-1189 | Toxic |
| D(+) – Glucose | ACROS | 41095-0010 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385 | |
| Erlenmeyer Flask | VWR | 89095-266 | Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap |
| Flash Freeze Flask | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| Freeze Dryer | VWR | 82019-038 | 4.5 L Benchtop |
| Glycerol | GibcoBRL | 15514-029 | |
| Incubator | New Brunswick | Innova 40 | Benchtop shaker |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911-100 | |
| Lysis Machine | MP Biomedicals | FastPrep-24 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | Benchtop |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | Benchtop |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco | 271310 | |
| NMR tubes | Norell | ST500-7 | 5mM |
| OADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| Oleic Acid | Sigma | O1008 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR | BDH0266 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | BDH0268 | |
| Rotor – Microfuge 22R | Beckman Coulter | F241.5P | Sealed and polypropylene |
| Rotor – Allegra X-15R | Beckman Coulter | SX4750 | With bio-certified covers |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 | Cambridge Isotope | DLM-48 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU-530 | |
| Spectrophotometer Cuvettes | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides |
| Syringe | Becton Dickinson | 309585 | Sterile, 3 ml Luer-Lok |
| Syringe Filter | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm sterile cellulose acetate |
| Tween 80 | Fisher Scientific | BP338-500 |
References
- Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
- Clarridge, J. E., Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
- Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
- Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
- Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
- Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
- Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
- Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
- Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
- Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
- Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
- Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
- Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
- Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
- Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
- Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
- Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
- Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
- Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
- de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
- de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
- Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
- Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
- Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
- Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
- Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
- Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
- Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
- Simpson, R. J., Inglis, J. . Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).
- Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
- Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. , (2011).
- Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).
- Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).
