Provberedning av<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Extrakt för Nuclear Magnetic Resonance studier Metabolomic
Summary
Den metabolomic profil<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Bestäms efter tillväxt i buljongkulturer. Förhållanden kan varieras för att testa effekterna av näringstillskott, oxidanter, och anti-tuberkulos medel på den metaboliska profilen för denna mikroorganism. Förfarande för extrakt förberedelse gäller både 1D<sup> 1</sup> H och 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> C NMR-analyser.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis är en viktig orsak till dödsfall hos människor på en global skala. Framväxten av både multi-(MDR) och i stor utsträckning-(XDR) läkemedelsresistenta stammar hotar att spåra ur nuvarande insatser för sjukdomsbekämpning. Således finns det ett akut behov av att utveckla läkemedel och vacciner som är mer effektiva än de som för närvarande finns tillgängliga. Genomet av M. tuberkulos har varit känt i mer än 10 år, men det finns stora luckor i vår kunskap om geners funktion och essentiala. Många studier har sedan använt analys genuttryck på både transcriptomic och proteomik nivåer för att bestämma effekterna av droger, oxidanter och villkor tillväxt på den globala mönster av genuttryck. Ytterst är det slutliga svaret hos dessa förändringar avspeglas i den metaboliska sammansättningen av bakterien inklusive några tusen små molekylvikt kemikalier. Jämföra de metaboliska profilerna för vildtyp och mutanta stammar, antingen obehandlade eller treated med ett särskilt läkemedel, kan effektivt tillåta mål identifiering och kan leda till utveckling av nya inhibitorer med anti-tuberkulos aktivitet. Likaså, kan effekterna av två eller flera förhållanden på Metabolome också bedömas. Kärnmagnetisk resonans (NMR) är en kraftfull teknik som används för att identifiera och kvantifiera metaboliska intermediärer. I detta protokoll förfaranden för framställning av M. tuberkulos cellextrakt för NMR metabolomic analys beskrivs. Cellkulturer odlas under lämpliga förhållanden och som krävs biosäkerhetsnivå 3 inneslutning, skördade 1, och utsattes för mekanisk lys samtidigt kyla för att maximera bevarandet av metaboliter. Cellysaten återvinns, filtreras steriliserades och lagrades vid extremt låga temperaturer. Alikvoter från dessa cellextrakt stryks ut på Middlebrook 7H9 agar för kolonibildande enheter för att kontrollera frånvaron av viabla celler. Vid två månaders inkubation vid 37 ° C, om inget VIsom kan kolonier observeras, prover ur inneslutningen anläggning för efterföljande bearbetning. Extrakten lyofiliseras, återsuspenderas i deutererad buffert och injicerades i NMR-instrument, fånga spektroskopiska data som sedan utsätts för statistisk analys. De beskrivna förfarandena kan tillämpas för både endimensionella (1D) 1 H-NMR och tvådimensionella (2D) 1 H-13 C-NMR-analyser. Denna metod ger mer tillförlitlig liten molekylvikt metabolit identifiering och mer tillförlitliga och känsliga kvantitativa analyser av metabola cellextrakt kompositioner än kromatografiska metoder. Variationer av den procedur som beskrivits efter cellys steget kan också anpassas för parallell proteomic analys.
Protocol
Discussion
Ett stort antal studier har analyserat transcriptomic och proteomik profiler M. tuberkulos under ett flertal in vitro-och in vivo-betingelser. 11-16 Slutligen, förändringar i genuttryck och enzymaktivitet leda till variationer i koncentrationerna av lågmolekylära molekyler. Den fullständiga beskrivningen av dessa föreningar utgör Metabolome. Således kan effekten av droger och varierande förhållanden tillväxt på metaboliska vägar att följas av metabolomic analys. 17,18</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka alla medlemmar i laboratorier Dr Barletta och Dr Powers för värdefulla kommentarer och samtidigt utveckla protokollet. Vi tackar Wendy Austin för hjälp diskussioner och korrekturläsning av manuskriptet. Det arbete som beskrivs i detta manuskript har finansierats av bidrag utsäde pilotprojekt till varje utredare ovan från University of Nebraska-Lincoln Redox biologi Center (förälder bidrag # NCRR 2P20RR 017.675, D. Becker, PI). Dessutom tackar vi Dr Ofelia Chacon för att ge pengar från hennes R21 bidrag (1R21AI087561-01A1) för forskning leveranser och Mr Halouska partiella lön stöd för att standardisera NMR-tekniker som ingår i denna publikation.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| ADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| BACS-120 Sample Changer | Bruker | ||
| Bruker Avance NMR | Bruker | 500 MHz | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Fraction V |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | Benchtop |
| Centrifuge Tubes | Corning | 430291 | 50 ml sterile polypropylene |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | 2.0 ml sterile polypropylene |
| Cycloheximide | A.G. Scientific | C-1189 | Toxic |
| D(+) – Glucose | ACROS | 41095-0010 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385 | |
| Erlenmeyer Flask | VWR | 89095-266 | Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap |
| Flash Freeze Flask | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| Freeze Dryer | VWR | 82019-038 | 4.5 L Benchtop |
| Glycerol | GibcoBRL | 15514-029 | |
| Incubator | New Brunswick | Innova 40 | Benchtop shaker |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911-100 | |
| Lysis Machine | MP Biomedicals | FastPrep-24 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | Benchtop |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | Benchtop |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco | 271310 | |
| NMR tubes | Norell | ST500-7 | 5mM |
| OADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| Oleic Acid | Sigma | O1008 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR | BDH0266 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | BDH0268 | |
| Rotor – Microfuge 22R | Beckman Coulter | F241.5P | Sealed and polypropylene |
| Rotor – Allegra X-15R | Beckman Coulter | SX4750 | With bio-certified covers |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 | Cambridge Isotope | DLM-48 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU-530 | |
| Spectrophotometer Cuvettes | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides |
| Syringe | Becton Dickinson | 309585 | Sterile, 3 ml Luer-Lok |
| Syringe Filter | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm sterile cellulose acetate |
| Tween 80 | Fisher Scientific | BP338-500 |
References
- Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
- Clarridge, J. E., Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
- Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
- Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
- Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
- Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
- Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
- Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
- Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
- Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
- Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
- Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
- Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
- Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
- Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
- Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
- Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
- Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
- Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
- de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
- de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
- Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
- Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
- Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
- Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
- Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
- Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
- Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
- Simpson, R. J., Inglis, J. . Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).
- Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
- Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. , (2011).
- Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).
- Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).
