Det<em> Drosophila</em> Egg kammer er en utmerket modell for å studere mekanismene for mRNA lokalisering. For å fange opp de dynamiske hendelser som understøtter prosessene i lokalisering, er rask høyoppløselig avbildning av levende vev er nødvendig. Her presenterer vi en protokoll for disseksjon og avbildning av levende prøver med minimale forstyrrelser.
Live-cell imaging er en viktig teknikk som brukes på en rekke Drosophila vev som brukes som modeller for å undersøke temaer som aksen spesifikasjon, celledifferensiering og organogenesen en. Riktig forberedelse av de eksperimentelle prøvene er en viktig, ofte neglisjert, step. Målet med forberedelse er å sikre fysiologiske relevans og å etablere optimale imaging forhold. For å opprettholde vev levedyktighet, er det avgjørende å unngå dehydrering, hypoksi, overoppheting eller medium forringelse to.
Den Drosophila egg kammeret er et godt etablert system for å undersøke spørsmål knyttet, men ikke begrenset til kropp mønster, mRNA lokalisering og cytoskeletal organisasjon 3,4. For tidlig-og midt-trinns egg kamre, montering i halocarbon olje er bra for overlevelse i at det tillater fri spredning av oksygen, forhindrer dehydrering og hypoksi og har ypperlige optiske egenskaper for mikroskopi. Imaldring av fluorescerende proteiner er mulig gjennom innføring av transgener inn i egget kammer eller fysisk injeksjon av merket RNA, proteiner eller antistoffer 5-7. For eksempel, gjør tillegg av MS2 konstruksjoner til genomet hos dyr sanntid observasjon av mRNA i oocyte 8. Disse konstruerer tillate for in vivo merking av mRNA gjennom utnyttelse av MS2 bakteriofag RNA stammen sløyfe samspill med pelsen protein 9.
Her presenterer vi en protokoll for utvinning av eggstokkene, samt isolere individuelle ovarioles og egg kamre fra den kvinnelige Drosophila. For en detaljert beskrivelse av Drosophila oogenesen See Allan C. Spradling (1993, gjengitt 2009) 10.
Live-celle imaging er en kraftig analysen for å undersøke cellulære prosesser i sanntid. I tillegg til enkle lyse felt observasjon, har tilsetning av fluorescerende etiketter til proteiner og RNA av interesse føre til mange gjennombrudd. Her har vi skissert en protokoll for imaging individuelle levende egg som kan benyttes i kombinasjon med genetiske og biokjemiske analyser.
I denne protokollen, vi også forklare hvordan man eksperimentelt manipulere levende egg ved injeksjon. Det er mange muligheter for materiale til å injisere, herunder in vitro syntetisert fluorescerende merket RNA til analysen muligheten for en sekundær struktur til direkte RNA lokalisering (Ball og Davis, upublisert) og antistoffer som hemmer funksjonen av proteiner 6. Fremtidig arbeid vil trolig se innledningen av andre merking komponenter og cellulære maskiner til levende egg slik at molekylære mekanismer som skal testes.
t "> Bevare levedyktigheten og helse av vevet er viktig når man arbeider med levende celler. I denne protokollen, peker vi ut en rekke tiltak som kan føre til stress av egg kammeret. For eksempel, til tross for olje være overlegen for bildebehandling, Utvidet kultur i oljen kan føre til stress på egg kammeret. Dette kan enkelt overvåkes under lyse felt eksponering ved å undersøke den kjernefysiske morfologi og posisjon, oocyte membran som vil forvrenge og bleb under stress (sammenlign figur 7E (trykklette) til Figure7F ( stresset)). Stage 9 egg kamre viser RNA lokalisering og grensen celle migrasjon 12 over flere timer. Men en scene 7/8 egg kammeret vil begynne å vise negative effekter i Halo karbon olje etter ca 40 minutter av eggstokken blir fjernet fra kvinnelige. sent stadium egg kamre, scene 11-14, kan utvikle seg normalt i enten olje eller vandige media på grunn av utskillelse av egg skallet fra follikkelen cellene ved disse stadiene 13. Det har vært reported at tillegg av insulin til vandig insekt medium kan opprettholde scene 9 egg i inntil 6 timer 14 og germaria opptil 14 timer 15. I alle tilfeller bør aggressiv manøvrering av egg kammeret unngås, da det fremhever de eggceller og reduserer dens levedyktighet. Imaging færre egg kamre og ta vare å behandle hver er forsiktig den beste måten å sikre optimal levedyktighet.The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Wellcome Trust Senior Research Fellowship til I. Davis.
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0) |
Available from most art supplies outlets | A good quality brush is important | |
Halocarbon Products Corporation, Series 95 | Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 | European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil. |
|
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
Dumont No.5 – Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | “Biologie” tip is also good but more fragile |
Dissecting probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
CO2 pad | Available through http://www.flystuff.com/ (A division of Genesee Scientific) |
59-114 (789060 Dutscher) |
European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads |
KimCare | Kimbery Clark-KimCare-Medical wipes | KLEW3020 | |
Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
Micromanipulator | Burleigh Micromanipulators from Lumen Dynamics Group inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, L5N 6H7 Canada |
Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
Injection apparatus | Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 |
MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
Injection needle | Eppendorf Sterile Femtotips I and II | 930000043 | Different tips are better for different applications |
Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
Dry active yeast | Fleischmann’s Yeast | #2192 |