Den<em> Drosophila</em> Ägg kammare är en utmärkt modell för att studera de mekanismer som mRNA lokalisering. För att fånga de dynamiska händelser som stöder processerna bakom lokalisering är en snabb hög upplösning avbildning av levande vävnad krävs. Här presenterar vi ett protokoll för dissektion och avbildning av levande prover med minimala störningar.
Levande cell imaging är en viktig teknik tillämpas på ett antal Drosophila vävnader som används som modeller för att undersöka ämnen som axeln specifikation, celldifferentiering och organogenesen 1. Korrekt beredning av de experimentella proverna är en avgörande, ofta försummas, steg. Målet för framställning är att säkerställa fysiologiska relevansen och att fastställa optimala avbildningsbetingelser. För att upprätthålla vävnadsviabilitet, är det viktigt att undvika uttorkning, hypoxi, överhettning eller medium försämring 2.
Drosophila ägget kammaren är ett väl etablerat system för att pröva frågor som rör, men inte begränsat till kroppen mönstring, mRNA lokalisering och cytoskelett organisation 3,4. För tidig-och mitten-stegs ägg kammare, montering i halogenkol olja är bra för överlevnad i det tillåter fri diffusion av syre, förhindrar uttorkning och hypoxi och har utmärkta optiska egenskaper för mikroskopi. Imåldring av fluorescerande proteiner är möjlig genom att införa transgener i ägget kammare eller fysikalisk injektion av märkt RNA, protein eller antikroppar 5-7. Exempelvis möjliggör tillsats av MS2-konstruktioner till genomet hos djur realtid observation av mRNA i oocyter 8. Dessa konstruktioner tillåter in vivo märkning av mRNA genom användning av MS2 bakteriofag RNA-svängstruktur interaktion med dess höljesprotein 9.
Här presenterar vi ett protokoll för utvinning av äggstockarna samt isolera enskilda ovarioles och kammare ägg från honan Drosophila. För en detaljerad beskrivning av Drosophila oogenes See Allan C. Spradling (1993, omtryckt 2009) 10.
Levande cell imaging är en kraftfull analys för att undersöka cellulära processer i realtid. Utöver enkla ljusfält observation har tillsättningen av fluorescerande markörer till proteiner och RNA av intresse leder till många genombrott. Här har vi har skisserat ett protokoll för avbildning enskilda levande oocyter som kan användas i kombination med genetiska och biokemiska analyser.
I detta protokoll förklarar vi också hur experimentellt att manipulera levande oocyter genom injektion. Det finns många möjligheter till materialet för att injicera, inklusive in vitro syntetiserade fluorescerande märkt RNA för analys av förmågan hos en sekundär struktur för att styra RNA-lokalisering (Bali och Davis, opublicerad) och antikroppar som inhiberar funktionen av proteiner 6. Framtida arbete kommer sannolikt se införandet av andra märkningskrav komponenter och cellulära maskineriet att levande oocyter som gör det möjligt molekylära mekanismer som ska testas.
t "> Bevara livskraften och hälsa vävnaden är viktigt när man arbetar med levande celler. I detta protokoll, vi påpeka ett antal åtgärder som kan leda till stress av ägget kammaren. Till exempel, trots att oljan är överlägsen för avbildning, förlängd kultur i oljan kan leda till stress på ägget kammaren. Detta kan lätt följas under starkt fältexponering genom att undersöka den nukleära morfologi och position, äggcellen membran som snedvrider och bubblan under stress (jämför figur 7E (obelastade) till Figure7F ( stressad)). Steg 9 ägg kamrar visar RNA lokalisering och gränser cellmigrering 12 över flera timmar. dock en scen 7/8 ägg kammaren kommer att börja uppvisa skadeverkningar i Halo kol-olja efter ca 40 minuter i äggstockarna tas bort från kvinnliga. sent stadium ägg kamrarna, steg 11 till 14, kan utvecklas normalt i antingen olja eller vattenhaltiga medier på grund av utsöndring av äggskalet från follikeln cellerna vid dessa stadier 13. Det har varit reparted att tillsatsen av insulin till vattenhaltiga insektsmedium kan upprätthålla steg 9 oocyter under upp till 6 timmar 14 och germaria upp till 14 timmar 15. I samtliga fall bör aggressiva manövrering av ägget kammaren undvikas, eftersom den betonar de oocyter och minskar dess livskraft. Imaging färre ägg kammare och var noga med att behandla varje är försiktigt det bästa sättet för att säkerställa optimal lönsamhet.The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en Wellcome Trust Senior Research Fellowship till I. Davis.
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0) |
Available from most art supplies outlets | A good quality brush is important | |
Halocarbon Products Corporation, Series 95 | Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 | European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil. |
|
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
Dumont No.5 – Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | “Biologie” tip is also good but more fragile |
Dissecting probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
CO2 pad | Available through http://www.flystuff.com/ (A division of Genesee Scientific) |
59-114 (789060 Dutscher) |
European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads |
KimCare | Kimbery Clark-KimCare-Medical wipes | KLEW3020 | |
Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
Micromanipulator | Burleigh Micromanipulators from Lumen Dynamics Group inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, L5N 6H7 Canada |
Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
Injection apparatus | Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 |
MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
Injection needle | Eppendorf Sterile Femtotips I and II | 930000043 | Different tips are better for different applications |
Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
Dry active yeast | Fleischmann’s Yeast | #2192 |