Systemet Oversigt Systemet består af tre hovedkomponenter: (1) en dobbeltvægget lyddæmpet rum (Industrial Akustisk Company, Bronx, New York) (2) en multipel kanal elektrofysiologiske registreringssystem (Neuralynx, Bozeman, MT), og (3) en fuldautomatisk, skræddersyet adfærdsmæssige testsystem fra Med Associates Inc. (St. Albans, VT). Som vist i figur 1A, er den operante kammeret placeret inde i lydisolerede rum. En kommutator (Model SL-36, Dragonfly forskning og udvikling, Inc., Ridgeley, West Virginia) til tilslutning af kabler fra hovedtrin til elektrofysiologiske registreringssystem (Figure1A-a), og et videokamera til overvågning og registrering af dyreadfærd er monteret oven den operante kammeret (Figure1A-b). Specialdesignede Operant Afdeling Den specialdesignede, akustisk transparent Operant kammer (Figure1A-d) består af tre akustisk transparente vægge og en modulær-operation panel (figur 1B). Tre højttalere (bur diskant, ENV_224BM, Med Associates) monteret på toppen af den midterste og to sidepaneler anvendes til emitterende auditive signaler. Auditive signaler genereres af en kalibreret, programmerbar audio generator (Anl-926). En stimulus lys (ENV_221M) og to triple-stimulus LED displays (ENV_222M) er placeret på den midterste og sidepaneler, hhv. Disse stimuli lys kan anvendes til auditive-visuelle multisensoriske adfærdsmæssige forsøg. En næse sækken enhed med tre farver lysdioder (ENV_114M) er monteret i bunden af den midterste panel. En infrarød detektor installeret i næsen sækken apparatet anvendes til at signalere næse stikker og opbevaringsperioden. LED lys i næsen poke enhed kan bruges til træning næse-hold inde i hullet. En bevægelig respons håndtaget (ENV_112CM) er monteret på hver side af operant panelet. Den mobility disse vægtstænger muliggør fleksibel styring af tilstedeværelsen af arme, som effektivt kan anvendes til både initial opgavetræning og undersøgelse af adskillige vigtige kognitive funktioner i hjernen (se nedenfor). Fire par af infrarød stråle kilder og detektorer (EVN_253SD) kontrolleret af en fire-kanals IR controller (ENV_253) er anbragt i bunden af kammeret til både angiver positionerne af dyret og styre andre enheder baseret på dyrets position (figur 1A- e). To pellets dispensere hver med en indbygget infrarød Sentry (ENV_203M-45IR) anvendes til udlevering belønninger i pelleten beholderne (fig. 1A-C). Den infrarøde Sentry anvendes til overvågning manglende pellet dispenser og tilvejebringelse advarselssignaler. System Configuration En oversigt over systemet forbindelser og hardware-komponenter er illustreret i figur 2. Funktionelt, der er to parallelle, interaktivesub-systemer: et for adfærd uddannelse og den anden for elektrofysiologiske optagelse. De to sub-systemer er synkroniseret via MED-pc-IV software platform (SOF-735). Computeren sender kommandoer til adfærdsmæssige indretninger og TTL pulser til neurale registreringssystem (signal strømme angivet ved de røde pile i figur 2), og modtager signaler, der frembringes ved dyrets responser og neurale aktiviteter (signal strømme angivet ved de grønne og blå pile, henholdsvis i figur 2). Disse parallelle, interaktive systemer muliggør optagelser af synkroniserede adfærdsmæssige / neuronal data og tillade manipulation af dyrets adfærd baseret på nerveaktivitet, eller vice versa. Behavior uddannelse sub-system A SmartCtrl Connection Panel (SG-716B) tjener som en to-vejs kommunikation panel: dvs at sende styresignaler (rød pil i figur 2) fra computer til de adfærdsmæssige anordninger opført i røde felt), og stansmit dyrets svarsignaler (grøn pil i figur 2) tilbage til computeren. Udgangene af de fire kanaler IR controller (ENV_253) også dirigeres ind tilslutningspanelet. En grænseflade card (SmartCtrl netkort, DIG-716B) og en dekoder kort (DIG-700F) formidle signaler fra forbindelsen panelet til et PCI-kort (DIG-704PCI) installeret på computeren. De auditive signaler genereres af Stimulus Generator (Anl-926), som også styres af MED-PC IV software via dekoder-kortet (DIG-700F). Som illustreret i figur 2, er alle interfacekort vært i en bordplade Grænseflade kabinet (SG-6080D). Dette kabinet leverer også beføjelser for alle adfærd enheder. Elektrofysiologiske optagelse sub-system Dyrenes svarsignaler, der modtages af computeren er momentant sendes til neurale optagelsen systemet via SuperPort TTL kortet (DIG-726) og Cheetah Digital Interface Box (Neuralynx, Bozeman, MT) (figur 2). Disse adfærd begivenheder er tidsstemplet og indspillet samtidig med neurale aktiviteter. Neurale pigge detekteret online fra Neuralynx registreringssystem kan anvendes som indgangssignaler til adfærdskontrol sub-system til at manipulere eller interfererende dyrets adfærd. Omvendt kan dyrets svarsignaler anvendes som udløser til at manipulere eller interferere neuronale aktiviteter, når det kombineres med elektriske eller optogenetic stimulering teknikker. Disse tiltag vil være værdifuld til at belyse årsagssammenhænge mellem neuronale aktiviteter og adfærd. Programmering og databehandling De adfærdsmæssige programmer er skrevet med Trans IV software (Thomas A. Tatham og MED Associates) og udarbejdet med Pascal compileren. Automatisering af hver træning trin realiseres ved at indlæse den Trans IV program i MED-pc-IV-software. Uddannelse parametre kan også indstilles online af undervisere wganske vist i MED-PC IV Software kører. De Trans IV koder skal være specifik for både system-opsætning og adfærdsmæssige opgave. Standard uddannelsesprogrammer, kan dog frit tilgængelige fra MED Associates og ændres for at opfylde individuelle laboratoriets specifikke behov. Uddannelsesprogrammer, der anvendes i vores opsætninger er også frit tilgængelige efter anmodning. Adfærdsmæssige data gemmes automatisk af MED-pc'en IV Software. De gemte data kan oversættes til Microsoft Excel-filer ved hjælp af MED-pc'en til Excel-program (MPC2XL, Thomas A. Tatham og MED Associates). De oversatte Excel-filer kan derefter importeres og analyseres i et MATLAB miljø (MathWorks, Natick, MA). De neurale data sammen med de adfærdsmæssige event tidsstempler optaget med Cheetah software (Cheetah 5, Neuralynx, Bozeman, MT) kan også importeres til MATLAB til analyse. Uddannelse For at illustrere driften af dette system, vi beskriver her enTo-alternative valg Pitch diskrimination opgave, der er designet til at undersøge hyppigheden diskrimination tærsklen af en rotte. En skematisk illustration af opgaven er vist i figur 3. 1. Pre-træning Begynde med naive voksen Sprague-Dawley, rotter, alder ~ 60 dage. Før træning, begrænse fødeindtagelse indtil dyrets vægt ~ 90% af basislinjen ad libitum vægt. 2. Cage Akklimatisering Til fremstilling kammeret for akklimatisering trække armene og blokere næsen sækken hul med en gummiprop (fremstillet af stemplet i en 60 ml sprøjte) til at forhindre dyr i at aktivere næse-sækken enhed. Place ~ 20 fuldt ernæringsmæssige piller (45 mg, Product # F0021, BioServ, Frenchtown, NJ) i hver pellet beholder (mad kop). Placer en naiv dyr i kammeret for akklimatisering. Rotten vil snart begynde at udforske de fødevarer kopper og spise pillerne. <li> Når begge fødevarer kopper er tomme, bruge softwaren kontrol til at afgive en enkelt pille i hver bakke. Dermed vil rotten lærer at forbinde mad med koppen. Tvinge rotte til at flytte til begge sider af kammeret ved dispensering pellets tilfældigt i hver føde bæger. En 30 minutters session er normalt nok til oprettelse af mad-Cup forening. I en 30 minutters behandling, sædvanligvis rotte opnår 200 – 300 pellets, der er tilstrækkelig til at opretholde deres kropsvægt på et konstant niveau på ~ 90% af basislinien. 3. Lever-push Uddannelse I en ny session, forlænger både håndtag ind i kammeret og lad maden kaffekoppen. Placér en akklimatiseret rotte ind i kammeret. Når dyret kommer ind i nærheden af en vægtstang, dispensere en pellet manuelt gennem Med-PC IV software. Også give belønninger, når rotten viser interesse i håndtaget, såsom snifning, røre, eller klatre. En utilsigtet løftestang skub bør også udløse en belønning autommatisk af programmet. At tilskynde håndtaget skubbe og tvinge udforskning af begge håndtag, så dyret kan skubbe hver arm konsekutivt et begrænset antal gange. Når grænsen er nået, trække håndtaget. Når begge håndtag har trukket, udvide dem til at gentage proceduren. Gradvist at reducere den grænse, indtil håndtaget trækkes tilbage, hver gang den bliver skubbet. En til to 30 minutters sessioner er normalt nok til oprettelse af håndtaget tryk – fødevarer belønning forening. 4. Næse-Poke Uddannelse I en ny session, trække armene, og fjern gummiproppen fra næsen sækken. Placer flere piller inde i næsen poke at tilskynde rotte interesse i at udforske næse-sækken enhed. Genindføre dyret ind i kammeret. Strække en af de to arme tilfældigt, når rotten snøfter næse-sækken hul til foderpiller. At se den udvidede håndtaget, vil rotten nærme og skubbe håndtaget for at opnå en fødevare pellad. Efter armen trykkes og belønningen dispenseres, trække håndtaget til fremme rotte at undersøge næsen sækken indretningen. Det tager normalt omkring 20 til 30 minutter at lære opgaven sekvens: Næse-poke → Lever forlængerledninger → Lever push-→ Rewards. 5. Cue Uddannelse I en ny session, spiller de auditive signaler efter en næse-stikke begivenhed med en kort forsinkelse (100 til 250 ms). Udvid både venstre og højre håndtag kort tid (100 ms) efter hver auditiv cue præsentation. Belønne rotten, når den skubber armen, der er angivet ved den auditive stikord. Dyret vil gradvist lære at associere en bestemt auditiv cue med ét greb. Dyret er så fri til at begynde en ny retssag med sekvensen: Næse-poke → Cue → Lever tryk → Reward / ingen belønning (Figur 3). På grund af høj falsk sats i de indledende læring sessioner, supplerende food bør overvejes at opretholde kropsvægt efter hver træning. I de næste mange 30 minutters sessioner, lad rotten praksis nyligt lærte opgave, indtil et ensartet ydelsesniveau er nået (se figur 3A for en typisk indlæringskurve). Når opgaven beherskes, kan en rotte opnå omkring 200 – 300 pellets i hver 30 minutter samling, som er tilstrækkelig til at opretholde sin kropsvægt. 6. Repræsentative resultater Efter ovennævnte protokol, at vi uddannede rotter genkender to forskellige mønstre for ren tone impulstog, der består af seks tone kerner med enten den samme frekvens (F, F, F, F, F, F) eller forskellige frekvenser (F, F-bf , F, F-df, F, F-bf) 1-5. Hver tone pip er 200 ms varighed, og tonen pip intervallet er 400 ms. I den foreliggende undersøgelse, blev F sat til at være 10 kHz og bf varierede fra 1 til 50% af F (fig. 3, øverst). Typisk blev df indstilletved relativt stor værdi under træning: 5 kHz, 4 kHz, 3 kHz, 2 kHz, og 1 kHz, for at lette uddannelsen. Hver rene tone pulstog med forskellig bf værdi blev præsenteret tilfældigt i en given session. To-alternative valg pitch Discrimination opgave er illustreret i figur 3. Rotter blev trænet til at stikke deres næsen ind i næsen hullet (fig. 1B og figur 3, nederste) for at starte en prøve. Næse Poke udløser udsendelse af de auditive signaler. Ved indregning af de tidskoder, skal rotter at køre til den rigtige side af kammeret, nærmer håndtaget, vente på håndtaget for at strække sig ind i kammeret, og derefter skubbe håndtaget inden for en bestemt tidsramme (håndtag aktiv tid, 1 til 2 sekund) for at opnå en belønning (figur 3). Hit blev beregnet for hver bf værdi som antallet af HIT forsøg divideret med det samlede antal forsøg for hver enkelt df værdi. Et kriterium på 75%hitraten blev anvendt til at indikere, at rotten havde fået opgaven. En typisk indlæringskurve en rotte er vist i figur 4A. Hver farvet streg viser den lærende fremskridt for hver pulstog med forskellig bf (ΔF0 repræsenterer konstant pulstog). I gennemsnit tog det omkring syv sessioner af træning (startende fra det første møde i auditive cue præsentation, Trin 5 Cue Training) for at nå 75% hit-rate kriterium. Systemet tillader også kvantitativ karakterisering af dyrets adfærd i udførelsen af opgaven designet af eksperimentatorerne. Tre målinger, der bruges meget i Dyreadfærdsundersøgelser er vist i figur 4 B – D Reaktionstiden, afspejler primært et dyrs opmærksomhed til opgaven, blev målt som funktion af tiden mellem starten af auditive cue og håndtag tryk.. Den inter-retssagen interval, hvilket afspejler, hvordan engageret et dyr var den opgave, som dyret indledt hvert forsøgog blev ikke straffet af time-out i falsk forsøg, blev plottet i figur 4C. Den tidsmæssige variation af resultater inden for en session, der repræsenterer de dynamiske mønstre efter dyrets samlede præstation og afspejler forbedring / tilpasning, som kan opstå inden for en enkelt session, blev plottet i figur 4D. Hver session blev inddelt i starten, midten, og sent tidspunkt (10 minutter pr fase). Akkumulerede antal gevinster i hvert trin blev anvendt i denne måling. Den neurale baggrund af flere kognitive adfærd (Figur 5A og se diskussion) kan også behandles med dette system ved registrering af neurale aktiviteter dyr udfører en opgave. Eksempler på neurale aktivitet registreret samtidigt i nucleus basalis (NB) og ventrale tegmentale område (VTA) af en rottehjerne er vist i figur 5B og C. Affyringer af neuroner er tidsstemplet at relatere hvert tilfælde af forsøg (f.eks som næse-poke,håndtaget tryk, auditive cue præsentation og anerkendelse, og faktiske modtagelse af belønning) og analyseret i forhold til disse adfærdsmæssige opgave begivenheder. Resultater af kombineret adfærdsmæssige og neurale aktivitet, optagelse med dette system vil være frugtbart i udredningen af neurale grundlag af en række kognitive adfærd. Figur 1. De vigtigste komponenter i systemet (A) og en skematisk tegning af custom-made auditive operant kammer (B). A. operant kammer er placeret i et dobbeltvægget lydtæt rum. Lyddøde skum kiler er monteret i hele rummets vægge til at fjerne lyd spredning og afbøjning en:. Kommutator for kabelføring til neuronal aktivitet registreringssystem, b: Video kamera til at overvåge og registrere dyrenes adfærd c: Pellet dispensere d: Operant kammer . e:Infrarøde modtagere. B. operant kammer omfatter tre akustisk transparente vægge og en modulær-betjeningspanel. Se tekst for detaljerede beskrivelser. Figur 2. Skematisk oversigt over systemet. Systemet består af to sub-systemer: adfærdsmæssige uddannelse og neurale aktivitet registreringssystem. De to delsystemer interaktivt kommunikere med hinanden via TTL pulser (se System Configuration for detaljer). De røde pile repræsenterer kommandoer og / eller adfærdsmæssige begivenheder sendes ud fra den computer, de grønne pile betegner dyr svarsignalerne fodring tilbage til computeren, og den blå pil repræsenterer signalindgange af neurale spike begivenheder detekteret online med Neuralynx registreringssystem. Figur 3. To Alternative ChOICE Frekvens Diskrimination Task. Top, blokdiagram, som viser den grundlæggende opgave sekvens. Bund, Skematisk visning af de vigtigste adfærdsmæssige tiltag. Grønne pile angiver den sekventielle strømmen af opgaven. Figur 4 Repræsentative resultaterne af to-alternative valg Frekvens Diskrimination Task A. Learning kurver:. Hver farvet streg repræsenterer det kognitive udvikling af en rotte på diskriminerer hver frekvens variation (ΔFs). Den mørke linje repræsenterer den gennemsnitlige indlæringskurve for frekvensvariationer. B. Fordeling af reaktionstid målt som tiden omgange fra starten af cue til armen tryk. C. Fordeling af inter-retssagen interval. D. tidsmæssige dynamik ydelse inden for en målt session med akkumulerede belønninger opnået i begyndelsen, midt og sent tidspunkt i en session. Enll dataene i B – D blev opnået i det sidste trin, når rotten resultater var over 75% hitraten. Figur 5. Eksempel på kognitive adfærd og hjernens funktioner, der kan undersøges ved hjælp af systemet. A. Kognitive adfærd. De bedste billedtekster beskriver de enkelte aktioner i en sekvens af en retssag. De nederste billedtekster angiver de kognitive adfærd, der kan studeres. Bemærk at begge arme blev ekstraheret i alle billeder undtagen i d når håndtaget er i behandlingen af strækker sig ind i kammeret. B. Firing mønstre af en neuron registreres i NB af en rotte udfører to valg auditive opgave. Top, rasterbillede plot affyre tværs af hvert forsøg. Hvert farvet rektangel repræsenterer affyring af cellen og fyring sats er kodet af farven. Bottom, Peri-selvt histogram af brændingen hastighed. Bemærk opbygningen af fyring før handling (skubbe håndtaget på tidspunkt nul mikrosekunder, som er angivet af den røde stiplede lodrette linje) og en gradvis spredning af fyring efter handlingen. C. Affyring af mønstre i et neuron registreret i VTA af en rotte udfører to-valg auditive opgave. Top, Raster billede plot af affyringen af en enkelt VTA neuron på tværs af de enkelte forsøg. Hver farvet rektangel repræsenterer affyring af VTA neuron og affyring hastighed er kodet af farve. Bund, Peri-arrangement histogram af fyringsgraden vist i rasterbilledet. Bemærk sparsomme affyringen umiddelbart før virkningen at skubbe armen (ved tid nul mikrosekunder, angivet ved den lodrette røde stiplede linie) og kraftig brænding i det tidsrum, hvor rotten opnåelse af belønning. Aktiviteten af denne neuron er næsten lydløs mellem disse to handlinger. Wolfram stereotrodes implanteret i hjernen blev anvendt til recwords neurale aktiviteter samtidigt fra NB og VTA medens rotte blev udfører opgaven. Spike-sortering blev udført off-line hjælp SpikeSort 3D Software (Neuralynx, Bozeman, MT).