تشريح والثقافة من الدوبامين والفأر Explants العقدة المخططة في ثلاثي الأبعاد فحوصات مصفوفة الكولاجين
Summary
وتستخدم Explants من المخ الأوسط نظام الدوبامين والمخطط في الكولاجين فحص مصفوفة لل<em> في المختبر</em> تحليل مسار التنمية mesostriatal ومخططي سودائي. ويمكن في هذا الاختبار يمكن التلاعب ثمرة محواري والتوجيه وكميا. يمكن أيضا أن يتم تعديل لتقييم مناطق أخرى أو منبهات الجزيئية.
Abstract
الدماغ المتوسط مشروع الدوبامين العصبية (mdDA) عبر حزمة الدماغ الأمامي وسطي نحو عدة مناطق في telencephalon، بما في ذلك المخطط 1. بالتبادل، شائك الخلايا العصبية المتوسطة في المخطط التي تؤدي إلى المسار (مباشر) مخططي سودائي عصب المادة السوداء 2. تطوير هذه المناطق محور عصبي يتوقف على اتخاذ إجراءات اندماجي من عدد كبير من نمو محور عصبي والعظة التوجيه بما في ذلك الجزيئات التي تم إصدارها من قبل neurites أو المناطق المستهدفة من قبل (وسيطة) 3،4. ويمكن دراسة هذه العوامل القابلة للذوبان في المختبر بواسطة mdDA زراعة و / أو explants الجسم المخطط في مصفوفة الكولاجين الذي يوفر الركيزة ثلاثي الأبعاد للمحاور عصبية محاكاة البيئة خارج الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، مصفوفة الكولاجين يسمح لتشكيل التدرجات مستقرة نسبيا من البروتينات الصادرة عن explants الأخرى أو خلايا وضعت في محيط (انظر على سبيل المثال المراجع 5 و 6). نحن هنا وصف طرائق بورification الكولاجين ذيل فأر، microdissection من explants الدوبامين والجسم المخطط وثقافتهم في المواد الهلامية الكولاجين واللاحقة تحليل المناعى والكمية. أولا، العقل المدبر للأجنة الفئران E14.5 هي المعزولة والدوبامين وmicrodissected explants الجسم المخطط. وبعد ذلك هذه explants (CO) مثقف في المواد الهلامية الكولاجين في coverslips لمدة 48 إلى 72 ساعة في المختبر. بعد ذلك، إسقاطات محواري وتصور باستخدام علامات العصبية (هيدروكسيلاز التيروزين على سبيل المثال، DARPP32، أو تويولين βIII) وكميا نمو محور عصبي والاستجابات محور عصبي جذاب أو مثير للاشمئزاز. هذه الخلايا العصبية هو إعداد أداة مفيدة لفي الدراسات المختبرية من الآليات الخلوية والجزيئية للنمو محور عصبي mesostriatal ومخططي سودائي والتوجيه خلال التنمية. باستخدام هذا الفحص، فإنه من الممكن أيضا لتقييم الآخرين (وسيطة) أهداف لمحاور عصبية الدوبامين والجسم المخطط أو لاختبار الاشارات الجزيئية محددة.
Protocol
Discussion
وصف فحص مصفوفة الكولاجين هنا قد استخدمت من قبل وتحسين معامل عديدة ومختلفة في العقود الماضية للتحقيق في مجموعة متنوعة من جزيئات توجيه محور عصبي، ونظم الخلايا العصبية (على سبيل المثال انظر المراجع 5-8). وقد أظهرت هذه الدراسات أن هذا الاختبار هو أداة قوية لدراسة الآثار و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تطوير فحص مصفوفة الكولاجين وتحسن من عمل العديد من المجموعات البحثية المختلفة خلال العقدين أو الثلاثة الماضية. النهج وصفها هنا لexplants الدوبامين والجسم المخطط تستفيد كثيرا من هذه الدراسات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر Asheeta براساد لمساعدتها في إنشاء ثقافات يزدرع الجسم المخطط. وقد تم تمويل العمل في المختبر من قبل منظمة حدود الإنسان برنامج العلوم (شهادة جائزة التنمية)، والمنظمة الهولندية للبحوث الصحية والتنمية (ZonMW-VIDI وZonMW TOP-)، والاتحاد Europanian (mdDA-NeuroDev، FP7/2007-2011 ، جرانت 222999) (لRJP)، والمنظمة الهولندية للبحوث العلمية (TopTalent؛ إلى ERES).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
