Dissection et de la culture de la souris dopaminergique et des explants striataux en trois dimensions dosages matrice de collagène
Summary
Explants du système dopaminergique mésencéphale et le striatum sont utilisés dans un essai de matrice de collagène pour la<em> In vitro</em> L'analyse du développement et de la voie striato mesostriatal. Dans cet essai la croissance axonale et d'orientation peuvent être manipulés et quantifiés. Il peut également être modifiée pour évaluer d'autres régions ou d'indices moléculaires.
Abstract
Dopamine du mésencéphale (MDDA) neurones du projet via le faisceau médian du cerveau antérieur vers plusieurs domaines dans le télencéphale, y compris le 1 striatum. Réciproquement, à moyen neurones épineux du striatum qui donnent lieu à l'striatonigrale (directe) voie innervent la substantia nigra 2. Le développement de ces secteurs axone dépend des actions combinatoires d'une pléthore de croissance des axones et des signaux de guidage, y compris des molécules qui sont libérées par neurites ou par régions cibles (intermédiaire) 3,4. Ces facteurs solubles peuvent être étudiés in vitro par MDDA culture et / ou des explants de striatum dans une matrice de collagène, qui fournit un substrat en trois dimensions pour les axones mimant l'environnement extracellulaire. En outre, la matrice de collagène permet la formation de gradients relativement stables de protéines libérées par des explants d'autres cellules ou placés dans le voisinage (par exemple voir les références 5 et 6). Nous décrivons ici les méthodes pour les finsification du collagène de queue de rat, de microdissection des explants dopaminergiques du striatum et, de leur culture dans des gels de collagène et après analyse immunohistochimique et quantitative. Tout d'abord, le cerveau des embryons de souris E14.5 sont isolées et dopaminergiques du striatum et les explants sont microdisséqué. Ces explants sont alors (co) cultivées dans des gels de collagène sur des lamelles de 48 à 72 heures in vitro. Par la suite, les projections axonales sont visualisées en utilisant des marqueurs neuronaux (par exemple la tyrosine hydroxylase, DARPP32, ou la tubuline βIII) et la croissance des axones et des réponses axonales attractives ou répulsives sont quantifiés. Cette préparation neuronale est un outil utile pour les études in vitro des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance axonale et mesostriatal striatonigrale et d'orientation au cours du développement. L'utilisation de ce test, il est également possible d'évaluer d'autres (intermédiaire) pour les cibles des axones dopaminergiques du striatum et de tester ou de signaux moléculaires spécifiques.
Protocol
Discussion
Le test matrice de collagène décrit ici a été utilisé et amélioré par de nombreux laboratoires différents dans les dernières décennies pour étudier une variété de molécules de guidage axonal et des systèmes neuronaux (par exemple voir les références 5-8). Ces études ont montré que ce test est un outil puissant pour étudier les effets et la régulation des molécules de guidage axonal sécrétées par différents tissus cibles (intermédiaire).
Toutefois, il convient de no…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le test matrice de collagène a été développé et amélioré par le travail de nombreux groupes de recherche différents au cours des deux à trois dernières décennies. Les approches décrites ici pour explants dopaminergiques du striatum et grandement bénéficier de ces études. En outre, les auteurs tiennent à remercier Asheeta Prasad pour son aide dans la mise en place des cultures d'explants du striatum. Les travaux dans le laboratoire a été financé par l'Organisation Human Frontier Science Program (Prix du développement de carrière), l'Organisation néerlandaise de recherche en santé et le développement (ZonMw-VIDI et ZonMw-TOP), l'Union Europanian (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222 999) (à RJP), et l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (TopTalent; à ERES).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
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