דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן
Summary
Explants ממערכת המוח התיכון דופאמין הסטריאטום משמשים assay קולגן מטריקס עבור<em> במבחנה</em> ניתוח של פיתוח מסלול mesostriatal ו striatonigral. ב assay זו תוצאה הדרכה axonal והוא יכול לטפל לכמת. זה גם יכול להיות שונה להערכת באזורים אחרים או סימנים מולקולריים.
Abstract
הדופמין במוח התיכון (mdDA) נוירונים הפרויקט באמצעות צרור המוח הקדמי המדיאלי כלפי כמה אזורים telencephalon, כולל 1 הסטריאטום. הדדי, הנוירונים קוצניים בינוני בסטריאטום שיוצרים מסלול (ישיר) striatonigral innervate nigra substantia 2. פיתוח של שטחים אלה האקסון תלויה בפעולות קומבינטורית של שפע של צמיחה האקסון ואת רמזים הדרכה כולל מולקולות שפורסמו על ידי neurites או (ביניים) אזורים היעד 3,4. גורמים אלה מסיסים ניתן ללמוד במבחנה על ידי mdDA culturing ו / או explants striatal במטריצה קולגן אשר מספק מצע תלת מימדי על אקסונים מחקה את הסביבה תאיים. בנוסף, מטריקס מאפשרת קולגן ליצירת שיפועים יציבה יחסית של חלבונים שפורסמו על ידי explants או תאים אחרים המוצבים בסביבה (למשל, לראות את הפניות 5 ו -6). כאן אנו מתארים את שיטות פורification של קולגן עכברוש הזנב, microdissection explants של דופאמין ו striatal, התרבות שלהם ג'ל קולגן וניתוח immunohistochemical וכמותית שלאחר מכן. ראשית, במוחם של עוברי עכברים E14.5 הם מבודד דופאמין ו explants striatal הם microdissected. Explants אלה מכן (CO) בתרבית ג'ל קולגן על coverslips במשך 48 עד 72 שעות במבחנה. כתוצאה מכך, תחזיות axonal הם דמיינו באמצעות סמנים עצביים (tyrosine hydroxylase למשל, DARPP32 או טובולין βIII) וצמיחה האקסון ותגובות האקסון אטרקטיביים או דוחה הם הניתנים לכימות. זו הכנה עצבי הוא כלי שימושי עבור במבחנה של המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון mesostriatal ו striatonigral והדרכה במהלך הפיתוח. שימוש assay זה, אפשר גם להעריך אחרים (ביניים) מטרות אקסונים דופאמין ו striatal או לבדוק אותות מולקולריים מסוימים.
Protocol
Discussion
Assay מטריקס קולגן המתואר כאן נעשה שימוש ושיפרה ידי מעבדות רבות בעשורים האחרונים לחקור מגוון רחב של מולקולות האקסון הדרכה ומערכות עצביות (למשל לראות הפניות 5-8). מחקרים אלה הראו כי assay זה הוא כלי רב עוצמה לחקר תופעות ורגולציה של מולקולות האקסון הדרכה המופרשים על ידי (ביני…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Assay מטריצת הקולגן פותחה לשפר על ידי עבודה של הרבה קבוצות מחקר שונות במהלך השנתיים עד שלוש השנים האחרונות. הגישות המתוארות כאן explants דופאמין ו striatal תועלת רבה ממחקרים אלה. בנוסף, החוקרים מודים Asheeta פראסאד על עזרתה בהקמת תרבויות explant striatal. לעבוד במעבדה מומן על ידי ארגון Human תוכנית המדע הגבול (פיתוח פרס קריירה), ארגון הולנד למחקר בריאות ופיתוח (ZonMW-VIDI ZonMW ו-TOP), האיחוד Europanian (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , גרנט 222999) (כדי RJP), לבין ארגון הולנד למחקר מדעי (TopTalent, כדי Eres).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
