三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化
Summary
中脳ドーパミン系と線条体からの外植片は、のためにコラーゲンマトリックスアッセイで使用されている<em> in vitroで</emmesostriatalと線条体黒質経路の開発>分析。このアッセイでは軸索伸長やガイダンスを操作して定量することができる。また、他の地域や分子手がかりを評価するために変更することができます。
Abstract
線条体1を含む終脳のいくつかの分野に向かって内側前脳束を経由して中脳ドーパミン（mdDA）ニューロンのプロジェクト。相互に、線条体黒質（直接）経路を生み出す線条体の中型有棘ニューロンは黒質2を支配する。これらの軸索路の開発は、神経突起によって、または（中間）のターゲット領域3,4から放出される分子を含む軸索成長とガイダンスの手がかりの茄多の組合せの行動に依存しています。これらの可溶性因子は、細胞外環境を模倣した軸索の三次元基板を提供するコラーゲンマトリックスで培養mdDA、そして/または、線条体の外植片によって in vitro で検討することができます。さらに、コラーゲンマトリックス（例えば、参考文献5および6を参照）近傍に配置された他の外植片または細胞から放出されるタンパク質の比較的安定した勾配の形成が可能になります。ここでは、PUR用のメソッドを記述するコラーゲンゲルとその後の免疫組織化学的および定量分析でラット尾コラーゲン、ドーパミンと線条体の外植片の顕微解剖、自分たちの文化のification。最初に、E14.5マウス胚の脳は、絶縁されており、ドーパミンと線条体の外植片は、マイクロダイセクションされています。これらの外植片は、その後の（共）、in vitroで 48から72時間のカバースリップ上にコラーゲンゲル内で培養されています。その後、軸索突起が定量化されるニューロンマーカー（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ、DARPP32、またはβIIIチューブリン）と、軸索の成長と魅力的または反発軸索応答を用いて可視化されています。この神経細胞の調製は、開発時にmesostriatalと線条体黒質軸索成長とガイダンスの細胞および分子メカニズムのin vitro試験のための便利なツールです。このアッセイを使用して、それがドーパミンと線条体軸索のために他の（中間）の目標を評価するために、または特定の分子の手がかりをテストすることも可能です。
Protocol
Discussion
コラーゲンマトリックスアッセイは、ここで説明する（例えば、参照する5-8を参照）軸索ガイダンス分子と神経系の様々を調査するために過去数十年の多くの異なるラボで使用され、改善されました。これらの研究は、このアッセイは、効果と異なる（中間）の標的組織から分泌される軸索ガイダンス分子の調節を研究するための強力なツールであることが示されている。
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
コラーゲンマトリックスのアッセイは、過去二から三十年の間に多くの異なった研究グループの作業によって開発され、改善されました。ドーパミンと線条体の外植片のためにここで説明するアプローチは非常にこれらの研究から恩恵を受ける。さらに、著者らは、線条体の外植片培養を設定する際に彼女の助けをAsheetaプラサドに感謝します。ラボでの作業は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム推進機構（キャリア開発賞）によって資金を供給され、健康の研究開発のオランダ機構（ZonMW-ビディとZonMW-TOP）、Europanian連合（mdDA-NeuroDev、FP7/2007-2011 、グラント222999）（RJPに）、および科学研究費オランダ機構（TopTalent、ERESに）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
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