Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale
Summary
Espianti dal sistema dopaminergico mesencefalo e striato sono utilizzati in un saggio per la matrice di collagene<em> In vitro</em> L'analisi dei pathway di sviluppo mesostriatal e striatonigral. In questo saggio crescita degli assoni e la guida può essere manipolato e quantificati. Può anche essere modificato per valutare altre regioni o segnali molecolari.
Abstract
Mesencefalo dopamina (mdDA) progetto di neuroni attraverso il fascio proencefalo mediale verso diverse aree del telencefalo, compreso il corpo striato 1. Reciprocamente, i neuroni spinosi medi del corpo striato che danno luogo alla striatonigral (diretto) via innervano la substantia nigra 2. Lo sviluppo di questi tratti assoni dipende dalle azioni combinatorie di una pletora di crescita degli assoni e spunti di orientamento tra le molecole che vengono rilasciati dai neuriti (o intermedio) regioni obiettivo 3,4. Questi fattori solubili possono essere studiate in vitro da mdDA coltura e / o espianti striatali in una matrice di collagene che fornisce un substrato tridimensionale per gli assoni che mimano l'ambiente extracellulare. Inoltre, la matrice di collagene consente la formazione di gradienti relativamente stabili di proteine rilasciate da espianti altri o cellule poste in prossimità (ad esempio si vedano i riferimenti 5 e 6). Qui si descrivono i metodi per i PURificazione di collagene coda di ratto, microdissezione di espianti dopaminergici e striatali, la loro cultura in gel di collagene e la successiva analisi immunoistochimica e quantitativa. In primo luogo, E14.5 il cervello di embrioni di topo sono isolate e dopaminergici e striatali espianti sono microdissezionate. Questi espianti sono poi (co) coltivati in gel di collagene su vetrini coprioggetto per 48 a 72 ore in vitro. Successivamente, le proiezioni assonali sono visualizzati utilizzando marcatori neuronali (ad esempio la tirosina idrossilasi, DARPP32 o tubulina βIII) e la crescita degli assoni e le risposte degli assoni attrattiva o repulsiva vengono quantificati. Questa preparazione neuronale è uno strumento utile per studi in vitro dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni e mesostriatal striatonigral e guida durante lo sviluppo. Usando questo saggio, è anche possibile valutare altri (intermedio) obiettivi per assoni dopaminergici e striatali o per testare specifici segnali molecolari.
Protocol
Discussion
Il saggio matrice di collagene qui descritto è stato utilizzato e migliorato da molti laboratori diversi negli ultimi decenni a indagare su una varietà di molecole e sistemi di orientamento degli assoni neuronali (ad esempio si vedano i riferimenti 5-8). Questi studi hanno dimostrato che questo dosaggio è un potente strumento per studiare gli effetti e la regolazione delle molecole di orientamento degli assoni secrete da diversi (intermedio), tessuti bersaglio.
Tuttavia, occorre notare ch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il saggio matrice di collagene è stato sviluppato e migliorato dal lavoro di molti gruppi di ricerca diversi nel corso degli ultimi due o tre decenni. Gli approcci descritti qui per espianti dopaminergici e striatali trarre grandi vantaggi da questi studi. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Asheeta Prasad per il suo aiuto nella creazione di culture espianti striatali. Lavorare in laboratorio è stato finanziato dalla Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), l'Organizzazione olandese di ricerca sulla salute e lo sviluppo (ZonMW-VIDI e ZonMW-TOP), l'Unione Europanian (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222.999) (a RJP), e l'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (TopTalent: per ERES).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
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