Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)
Summary
Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.
Abstract
O cromossoma bacteriano pode ser utilizado para manter de forma estável de ADN estranho na gama mega-base 1. Integração no cromossoma contorna questões tais como a replicação do plasmídeo, a estabilidade do plasmídeo, a incompatibilidade do plasmídeo, e variância número plasmídeo de cópia. Este método utiliza a integrase site-specific a partir do fago de Streptomyces (Φ) C31 2,3. A integrase ΦC31 catalisa uma recombinação direta entre dois sítios de DNA específicas: attB e attP (34 e 39 pb, respectivamente) 4. Esta recombinação é estável e não revertem 5. A "pista" sequência (LP), constituído por um gene de resistência à espectinomicina, aadA (SPR), ea E. gene coli ß-glucuronidase (uidA) ladeado por sites attP foi integrado nos cromossomos de Sinorhizobium meliloti, anthropi Ochrobactrum e Agrobacterium tumefaciens em uma região intergênica, a ampC locus, eo locus Teta, respectivamente. S. meliloti é usado neste protocolo. Vectores de dadores contendo locais attB mobilizável que flanqueiam um stuffer vermelho fluorescente proteína do gene (SDP) e um gene de resistência a antibiótico também têm sido construída. Neste exemplo, o pJH110 resistente gentamicina plasmídeo é usado. O gene rfp 6 pode ser substituída com uma construção desejada utilizando Sph I e Pst I. Alternativamente um construto sintético flanqueado por sítios attB podem ser sub-clonado num vector mobilizável, tais como pK19mob 7. A expressão do gene da integrase ΦC31 (clonado a partir de pHS62 8) é conduzida pelo promotor lac, em uma ampla gama de hospedeiros mobilizável plasmídeo pRK7813 9.
Um protocolo de acasalamento tetraparental é usado para transferir a cassete de doador na estirpe LP substituindo assim os marcadores na sequência de LP com a cassete de dador. Estas células são trans-integrantes. Trans-integrantes são formados com uma eficiência típica de 0,5%. Trans-integrantes são tipicamente encontrados nos primeiros 500-1,000 colónias filtradas através da sensibilidade aos antibióticos ou azul-branco rastreio utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucurónico ácido (X-gluc). Este protocolo contém os procedimentos de acasalamento e de seleção para criar e isolar trans-integrantes.
Protocol
Discussion
A técnica IMCE permite a eficiente integração de uma cassete de ADN único attB flanqueada no LP-locus de uma estirpe previamente manipulada. Uma vez que a construção desejada é clonado no lugar de rfp para criar a cassete de dador, a técnica não requer purificação de ADN e transformação subsequente, o que torna muito robusta. É crítico que controla o crescimento adequados estão incluídos, para ser determinada a resistência a antibióticos é devido à criação de trans-integrantes e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Para Margaret CM Smith por gentilmente fornecer o clone integrase
Apoio financeiro de:
Genoma Canadá / Genoma Prairie
NSERC Discovery e subsídios projeto estratégico
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
