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사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

DOI:

10.3791/3698

⸱

March 16th, 2012

 ,  , 
1Biology, University of Waterloo

In This Article

Summary

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미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.

Abstract

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박테리아 염색체가 안정적으로 메가베이스 범위의 1에 외국의 DNA를 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 염색체에 통합은 플라스미드 복제, 플라스미드 안정성, 플라스미드 호환성 및 플라스미드 사본 번호 분산 등의 문제를 circumvents. 이 방법은 Streptomyces 파지 (Φ) C31 2,3에서 특정 사이트 integrase를 사용합니다. attB 및 attP (각각 34 39 BP) 4 : ΦC31 integrase 두 개의 특정 유전자 사이트 간의 직접적인 재조합을 catalyzes. 이러한 재조합은 안정하고 5 되돌릴 수 없습니다. spectinomycin - 저항 유전자, aadA (SpR), 그리고 E. 구성된 "방문 패드"(LP) 시퀀스 attP 사이트의 어귀 대장균 SS-glucuronidase 유전자가 (uidA) Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi 및 intergenic 지역의 Agrobacterium tumefaciens의의 염색체에 통합되었고, 오전각각 PC 현장, 그리고 tetA 현장. S. meliloti이 프로토콜에서 사용됩니다. stuffer 적색 형광 단백질 (RFP) 유전자와 항생제 내성 유전자 측면을 노릴 attB 사이트가있는 Mobilizable 기증자 벡터도 구축되었습니다. 이 예제에서는 gentamicin 내성 플라스미드 pJH110이 사용됩니다. RFP 유전자 6 SPH I 및 PST 나를 사용하여 원하는 구조로 대체될 수 있습니다 또는 attB 사이트의 어귀 합성 구조는 pK19mob 7과 mobilizable 벡터에 서브 복제있을 수 있습니다. ΦC31 integrase 유전자 (pHS62 8 일부터 복제)의 표현은 pRK7813 9 플라스미드 mobilizable 광범위한 호스트 범위에 LAC 프로 모터에 의해 구동됩니다.

tetraparental 짝짓기 프로토콜은 LP 변형이 됨으로써 기증자 카세트와 LP 시퀀스에서 마커를 교체로 기증자 카세트를 전송하는 데 사용됩니다. 이러한 세포는 트란입니다S-integrants. 횡단 integrants은 0.5 %의 전형적인 효율을 형성하고 있습니다. 횡단 integrants는 일반적으로 5 - 브로모 -4 - 클로로 -3 - 인돌릴 - 베타-D-glucuronic 이상해진 (X-gluc)을 사용하여 항생제 감수성이나 청색 - 흰색 심사에 의해 상영 첫 500-1,000 식민지 내에 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 횡단 integrants를 생성하고 분리를위한 짝짓기 및 선정 절차가 포함되어 있습니다.

Protocol

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1. 문화 생산

  1. 타이 10 (5g / L tryptone, 3g / L 효모 추출물, 0.44 g / L 칼슘 염화물 탈수) 및 LB 11 (10g / L tryptone, 5g / L 효모 추출물, 5 G / : 무균 액체 매체를 준비합니다 나트륨 염화물, 산도 7).
  2. SmUW227 : 50 μg / ML의 spectinomycin와 타이의 미디어 (S. meliloti 천자 - 변형 : 건설 다른 곳에서 설명한 것이다는 요청시 사용 가능한 건축 세부 변형) () 5에 ML 단일 콜로니 접종. E. : 주어진 항생제와 보완 다음과 같은 변종 LB 액체 매체의 5 ML로를 접종 대장균은 DH5α 12 10 μg / ML 테트라 사이클린과 pJC2, 플라스미드 integrase 표현식을 포함하는, E. 대장균 10 μg / ML의 chloramphenicol과 MT616 13 mobilizer, 및 E. 대장균 DH5α 5 μg / ML의 gentamicin과 pJH110, 플라스미드 기증자 카세트를 포함하는.
  3. 품어 E. 37 AT & 하룻밤 대장균의

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Discussion

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IMCE 기술은 이전에 설계 변형율의 LP-현장으로 단일 attB 어귀의 DNA 카세트의 효율적인 통합을 허용합니다. 원하는 구조가 기증자 카세트를 만드는 RFP 자리에 복제되면 기술은 매우 강력하고, 이후 DNA를 정제 및 변환을 필요로하지 않습니다. 그것은 항생제 저항이 횡단 integrants 및 기타 아니라 요소의 생성에 의한 특정 말하면, 적절한 성장 컨트롤이 포함되어있는 것이 중요합니다.

IMCE은 약 0.5 %의 효율로 횡단 integrants을 생산하고 있습니다. 대조적으로, 동종 재조합을 통해 더블 크로스 오버는 -6 약 10의 주파수에서 발생합니다. λ-빨강 16, 또 다른 파지 기반 시스템을 통해 Recombineering 것은 특정 상동 있어야하고, E.의 외부 효과를 다양했습니다 대장균 17. 또 다른 옵션은 Tn7 사이트 구체적인.......

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Disclosures

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

친절 integrase의 클론을 제공하는 마가렛 CM 스미스에게
부터 지원 자금 :
게놈 캐나다 / 게놈 프레리
NSERC 발견과 전략적 사업 보조금

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
스트렙토 마이신 Bioshop 캐나다 주식 회사 STP101
Spectinomycin Bioshop 캐나다 주식 회사 SPE201
Gentamicin Bioshop 캐나다 주식 회사 GTA202
Choramphenicol Bioshop 캐나다 주식 회사 CLR201
테트라 싸이클린 Bioshop 캐나다 주식 회사 TET701
Kanamycin Bioshop 캐나다 주식 회사 KAN201
세균 학년 한천 Bioshop 캐나다 주식 회사 AGR001
Tryptone Bioshop 캐나다 주식 회사 TRP402
효모 엑기스 Bioshop 캐나다 주식 회사 YEX401
나트륨 염화물 Bioshop 캐나다 주식 회사 SOD001
염화칼슘 Bioshop 캐나다 주식 회사 CCL444
X-gluc 골드 바이오 주식 회사 G1281C1
E. 대장균 MT616 변형 요청시 사용 가능 또한 저희 실험실 밖에서 사용되는
E. 대장균 pJC2 변형 요청에 의해 집안에서 사용 가능한
E. 대장균 pJH110 변형 reques에 의한 하우스에서 사용 가능한티
SmUW227 변형 요청에 의해 집안에서 사용 가능한

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
  2. Kushtoss, S., Rao, R. N.

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Bacterial Chromosome EngineeringSite specific IntegraseCassette ExchangePhiC31 IntegraseLanding Pad SequenceMobilizable Donor VectorsTetraparental Mating ProtocolTrans integrant SelectionAntibiotic Sensitivity ScreeningBlue white Screening

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