마우스를 사용 Tracheal 수축의 체외 측정에서

Summary

형질 전환 생쥐는 유전자로 생리 기능을 ascribing에서 매우 유용한되었습니다. 일반적으로 같은, 연구하고,기도의 기능적 연구로서 특히, murine 모델 향한 놀라운 변화를받은. 여기에 대한 프로토콜을 제공 체외에서기도의 수축 연구 murine기도의 평활근 기능을 평가합니다.

Abstract

유전자 변형 및 녹아웃 마우스는 항공 ^1,2의 생리학과 pathophysiology의 조사를위한 강력한 도구왔다. 격리된 tracheal 준비 시험 관내 tensometry에서기도 부드러운 근육 (ASM) 유전자 변형 생쥐의 수축성 응답의 유용한 분석 것으로 입증되었습니다. 체외 tracheal 준비에 이들은 비교적 간단이며, 강력한 응답을 제공하고, 기능 cholinergic 신경 엔딩과 근육 반응도 긴 incubations 후 양쪽을 유지합니다.

Tracheal tensometry 또한 평활근의 수축에 영향을 미치는 두번째 메신저 신호 경로의 다양성을 공부하는 기능적 분석을 제공합니다. 기도의 수축은 주로 ASM (그림 1)에 아세틸콜린을 공개한다는 parasympathetic, cholinergic 신경에 의해 매개된다. 주요 ASM 아세틸콜린 수용체는 각각 G _{I / O} 및 GQ 결합 수용체입니다 muscarinic M2와 M3입니다 3,6,7의 증가 IP3 생산과 IP3-매개 칼슘 릴리스를 활성화하기 위해 GQ에 결합하여 수축을 보여주고 있습니다. M2 / G _{I / O} 신호는 캠프 레벨 ^5,8,9,10의 감소로 이어지는 adenylate cyclase의 억제에 의해 수축을 향상시키기 위해 생각됩니다. 이러한 경로는기도 부드러운 근육 ^{11 일} 소위 "pharmaco - 수축 결합"을 구성합니다. 또한, M2 수용체를 통해 cholinergic 신호 (및 M3 신호에 의해 변조된)가 차례로 L-타입, 전압 의존 칼슘 채널 (그림 1) 그래서 "여기 - 수축 결합"이라는 칼슘 유입을 (활성화하는 ASM을 depolarize 경로를 포함 ) ^4,7. 기도 수축을 제어 경로 신호에 대한 더 자세한 리뷰는 ^4,12를 찾을 수 있습니다. 위의 경로는 생쥐와 다른 종 사이에 보존되어있는 것으로 나타났습니다. 그러나 마우스 tracheas 다른 종의 차이가 나는N 일부는 경로 신호. 가장 눈에 띄는는 히스타민과 아데노신 ^13,14으로 수축성 반응, 인간과 다른 종의 ^5,15에서 모두 잘 알려진 ASM 변조기 그들의 부족이다.

여기 murine tracheal 반지의 절연을위한 프로토콜과 수축성 출력의 체외 측정에서 제시. 포함하는 장비 구성에 대한 설명이며, 호흡 관 링 절연 및 수축성 측정. 예제는 전압 의존 칼슘 유입을 활성화 높은 칼륨 신경의 자극과 직접적으로 ASM 근육의 탈분극하여 사용하여 간접적으로 수축을 evoking 위해 제공됩니다 (1. 높은 K ^+, 그림 1). 또한, 방법은 전기장 자극을 (2. EFS 그림 1) 외인성 신경 전달 물질을 사용하여 ASM 근육, 또는 직접적인 자극이 목욕탕 (3. 외인성 ACH, 그림 1)에 적용된 사용 혼자 신경 stimulations 위해 제공됩니다. 이 flexibility와 준비의 용이성은 절연 기관 링 모델에게기도 평활근의 수축에 관여 폭포 신호의 숫자를위한 강력하고 기능적인 분석을 렌더링.

Protocol

1. 장비

수축 측정 장치의 주요 구성 요소) 그림 2A에서 간략하게 구조 표시됩니다.

1. 조직 욕조가. 조직 욕조는 따뜻한 온도에서 산소 생리 솔루션을 유지 관리합니다. 생쥐기도 고리의 경우, 우리는 온난 화 솔루션 fritted 유리 거품 산소에 유입구 (95 % / 5퍼센트 O ₂ / CO ₂ 혼합)와 유입과 변화를위한 콘센트 포트를 순환을 위해 물 재킷을 포함 10 ML 조직 목욕을 사용 솔루션. 저수지의 PSS 솔루션은 95 % 일정한 기포 37 ° C 물 목욕 (보이지 않음).에서 / 5퍼센트 O ₂ / CO ₂ 혼합과 함께 저장됩니다 솔루션 교환의 경우 PSS 솔루션은 비교적 빠른 솔루션의 교환을 허용하도록 저수지에서 약 100 MLS 분당에서 조직 목욕탕 입구 (하단 포트)로 펌핑된다. 솔루션 콘센트는 조직 배트에 일정한 볼륨 (~ 10 ml) 쇼핑있게 오버플 포트 (상단 포트)를 통해서솔루션 교환시 H. 우리는 (37 ° C를 유지하기 위하여) 조직 목욕 자켓을 통해 온수를 공급 Haake 가열 순환 장치를 사용합니다. 조직 온천은 공급 업체의 숫자로부터 얻은 및 수사관....

Discussion

여기에 제시된 프로토콜은기도 근육의 기능을 평가하는 생리적 준비를 제공합니다. 우리는 일반적으로 동시에 3-4 장기 목욕 준비를 운영하지만, prepackaged 시스템은 8 준비 (ADInstruments, 세계 정밀 계측기, 그리고 하버드 장치)까지 동시 측정을 허용 공급 업체에서 제공합니다. 우리는 이에 상응하는 결과를 강제로 트랜스 듀서 및 조직 장기 온천의 번호를 이용했습니다. 그러나 전기장 자극은 자극 전극 크기, 전극 판 사이의 거리, 그리고 전기장 내에서 준비의 위치 사이에 약간의 차이를 기준으로 일부 다양성을 제공 찾으십시오. 따라서 별도의주의가 가능한 유사한 필드 전극을 만들기 위해 수행되어야한다.

사시 힘 측정에서 가장 중요한 변수 중 하나는 근육 질량의 변화에​​ 대한 보상하기 위해 수축을 정상화의 문제, 또는다른 준비를 사이에 근육 조직의 건강. 부분에서 차이점과 비슷한 연령과 같은 성별 (암 생쥐가 축소기도 장력을 발생하는 경향)의 동물을 비교하여 최.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아날로그 - 디지털 컨버터	ADInstruments	PowerLab 35분의 4
Carbachol (Carbamoylcholine 염화)	시그마 - 올드 리치	C4832	물에 10 -2 M (aliquots는 -20 ° C에 저장할 수 있습니다)
차트 소프트웨어	ADInstrtuments	LabChart
난방 순환 장치	Haake	믹서 밀 MM400
사시 포스 트랜스 듀서	켄트 과학	TRN001
자극기	잔디 기술	S88 듀얼 출력 Squ펄스 자극기입니다
조직 바스	WPI	47,264