Nylige fremskridt inden for to-foton-mikroskopi har muliggjort realtid<em> I</em> Situ billeddannelse af levende væv i dyremodeller, hvorved man forbedrer evnen til at undersøge cellulær adfærd i både fysiologiske og patologiske betingelser. Her vil vi redegøre for de nødvendige forberedelser til at udføre intravital billeddannelse af musen popliteale lymfeknude.
Lymfeknuder (LN) er sekundære lymfoide organer, som er strategisk placeret i hele kroppen for at tillade indfangning og præsentation af fremmede antigener fra perifere væv til at prime den adaptive immunreaktion. Sammenstillet mellem medfødte og adaptive immunrespons, at LN er et ideelt sted at studere immun celle interaktioner 1,2. Lymfocytter (T-celler, B-celler og NK-celler), dendritiske celler (DC'er), og makrofager omfatter hovedparten af knoglemarv-afledte cellulære elementer i LN. Disse celler er strategisk placeret i LN at muliggøre en effektiv overvågning af selv-antigener og potentielle udenlandske antigener 3-5. Den proces, ved hvilken lymfocytter held støder beslægtede antigener er en genstand for intens undersøgelse i de senere år, og omfatter en integration af molekylære kontakter, herunder antigen-receptorer, adhæsionsmolekyler, kemokiner og stromale strukturer såsom fibro-retikulære netværk 2,6-12 . </p>
Forud for udviklingen af høj-opløsning real-time fluorescerende in vivo billeddannelse, efterforskere har påberåbt sig statisk billeddannelse, som kun giver svar vedrørende morfologi, placering og arkitektur. Selv om disse spørgsmål er grundlæggende i vores forståelse af immun celle adfærd, er de begrænsninger, der med denne teknik ikke tillader analyse til at dechifrere lymfocyt menneskehandel og miljømæssige spor, der påvirker dynamiske celle adfærd. For nylig, udvikling af intravital to-foton laser scanning mikroskopi (2P-LSM) har gjort det muligt for forskerne at se de dynamiske bevægelser og interaktioner af de enkelte celler i live LN i stedet 12-16. Især har vi og andre anvendes denne teknik til billede cellulær adfærd og interaktioner inden den popliteale LN, hvor den kompakte, tætte natur giver den fordel, multipleks dataopsamling over et stort vævsområde med forskellige væv sub-strukturer 11,17-18 . Det jeger vigtigt at bemærke, at denne teknik giver ekstra fordele i forhold til eksplanteret væv billedbehandling teknikker, som kræver afbrydelse af blod, lymfe flow, og i sidste ende de cellulære dynamik i systemet. Derudover eksplanterede væv har en meget begrænset tidsvindue, hvor vævet forbliver levedygtige efter billeddannelse efter eksplantation. Med ordentlig hydrering og overvågning af dyrets miljøforhold, kan den billeddannelse tiden blive udvidet betydeligt med denne intravital teknik. Her præsenterer vi en detaljeret metode til fremstilling af mus popliteal LN med det formål at udføre intravital billeddannelse.
Nylige fremskridt i høj opløsning in situ billeddannelsesteknikker, især 2P-LSM, er blevet ledsaget af en voksende interesse i studiet af dynamiske cellulær adfærd in vivo. Den 4D billeddannelse teknik på popliteale LN af en levende mus tillader sådanne analyser i den dynamiske opførsel af immunceller i uafbrudt vævet mikro-miljø. Anvendelsen af 2P-LSM med flere detektorer, der spænder over hele det synlige spektrum tillader samtidig billeddannelse indsamling af multiple cellepopulationer. Dette kan nu opnås ved anvendelse af in vivo celle-specifikke fluorescerende reporter-mus (f.eks Ubiquitin-EGFP-RFP eller-eCFP) kombineret med anvendelsen af adoptiv overføring af differentielt mærkede cellepopulationer under anvendelse af organiske fluorescerende celler farvestoffer (fx CFSE , SNARF-1, og Cell Tracker Orange) at undersøge cellulære mekanismer og funktion inden for LN. Ud over direkte observation af interaktioner mellem differentielt spores cell befolkninger, kan multiplex imaging datasættet gennemgå yderligere analyser med kommercielt tilgængelige billeddiagnostiske behandling programmer (f.eks Imaris, BitPlane Inc.) til yderligere at belyse celle adfærd og funktion. En bred vifte af muligheder eksisterer for at studere cellulære mekanismer til interaktion med disse in vivo og in silico teknikker.
Den væsentligste begrænsning af den eksperimentelle fremgangsmåde, der beskrives her er den tekniske kompleksitet, der ligger i kirurgi tilgang. Denne teknik kræver hård træning at blive fortrolig med den relevante anatomi og de præcise tekniske procedurer og færdigheder som krævet i denne protokol. Yderligere komplicerende faktorer omfatter det er vanskeligt at minimere vævsskader under LN udforskning, optimering af væv stabilitet under billedbehandling, og forhindre termisk og laser skade på LN før og under billedbehandling eksperimenter. Forstyrrelse nogen af disse faktorer vil resultere i mindre end optimal lymfeknuderocyte motilitet og vil derfor interferere med den korrekte fortolkning af den resulterende billeddannelse dataanalyser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af tilskud fra NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick Fond, Dana Foundation, Gabrielle Angel Foundation, og Hyundai Motors of America "Hope-on-Wheels" Program.
Reagent | Company | Catalogue Number |
Isoflurane, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-773-60 |
Vetbond | 3M | 1469SB |
Nair – hair removal lotion | Nair | |
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV |
Heating pad | Watlow | |
Heating Pad Controller | Watlow | |
Air and O2 | Airgas | |
Temperature probe | Harvard Apparatus | |
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc | 14101 |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc | 14141 |
Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5880 |
Cover of 100×20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 |
Cover of 100×20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-150-08 |