माउस जानुपृष्ठीय लसीका नोड के intravital इमेजिंग

Summary

2-photon माइक्रोस्कोपी में हाल के अग्रिमों वास्तविक समय सक्षम है<em> में</em> पशु मॉडल में जीवित ऊतकों की स्वस्थानी इमेजिंग, जिससे हमारे दोनों शारीरिक और वैकृत शर्तों में सेलुलर व्यवहार की जांच करने की क्षमता को बढ़ाने. यहाँ, हम के लिए में माउस जानुपृष्ठीय लसीका नोड की intravital इमेजिंग प्रदर्शन के लिए आवश्यक तैयारी की रूपरेखा.

Abstract

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions^1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens^3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network^2,6-12.

Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ^12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures^11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal’s environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Protocol

1. माउस धारक विधानसभा एक 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के नीचे का सामना करना पड़ ढक्कन के शीर्ष पर एक 100 मिमी ग्लास पेट्री डिश के कवर ढ़कें. गिलास मुश्किल प्लास्टिक पकवान का केंद्र बिंदु को छू जाना चाहिए. कांच का प्रयोग एक स्टैंसिल के रूप में, प्लास्टिक पकवान पर एक निशान का पता लगाने. एक हाथ ड्रिल (यानी Dremel) का उपयोग करने के लिए एक 100 मिमी प्लास्टिक पकवान वर्धमान के आकार का एक मंच बनाने के ढक्कन के एक हिस्से को हटा दें. इस वर्धमान के आकार का प्लास्टिक ढक्कन माउस (चित्रा 1 क) के ऊपरी धड़ के लिए एक सहायता के रूप में सेवा करेंगे. वर्धमान के आकार का ढक्कन पर दो छेद ड्रिल करने के लिए एक धातु मोड़ टाई के साथ गैस मास्क सुरक्षित. सुपर गोंद या यों एक मजबूत चिपकने वाला (चित्रा 1b) का उपयोग करते हुए कांच पेट्री डिश के किनारे प्लास्टिक के ढक्कन सुरक्षित. गोंद दो गुंबददार – टोपी पीसीआर (काज में कटौती) ट्यूबों जानुपृष्ठीय त्वचा flaps के प्रस्तोता के प्रयोजन के लिए नीचे डिश के केंद्र के अलावा 1 सेमी के lids के. 2. माउस तैयार <stroएनजी> नोट: पर्याप्त अभ्यास के साथ, एक 20-30 मिनट में माउस तैयारी और शल्य कदम प्रदर्शन करने में सक्षम होना चाहिए. (शामिल करने के लिए 2 से 2.5%, सर्जरी / इमेजिंग के लिए 1.5 से 2%) isoflurane 01:01 2 हे में admixed माउस चतनाशून्य करना: हवा 1L/min के प्रवाह की दर में मिश्रण को मंजूरी दी प्रक्रिया IACUC का उपयोग. जब माउस संवेदनाहृत है, टेप के साथ नाक पर एक गैस मास्क सुरक्षित. निर्धारित अगर माउस पूरी तरह से प्रतिक्रिया की कमी से पैर की अंगुली और / या पूंछ pinches संवेदनाहृत है. isoflurane के स्तर के अनुसार समायोजित किया जा सकता है जानवर पूरी तरह से एक स्थिर, गैर – अस्वाभाविक 60-80 साँस / मिनट के बीच सांस की दर के साथ बेहोश है, करने के लिए सुनिश्चित करें. एक बिजली trimmer का प्रयोग सही हिंद पैर और माउस का वंक्षण क्षेत्र पर बालों को हटाने के लिए. दूर ढीले बाल ब्रश और धीरे मुंडा क्षेत्र पर एक कपास झाड़ू से नायर लोशन की एक मामूली कोट लागू होते हैं. प्रारंभिक आवेदन के एक मिनट के बाद, नायर को हटाने और एक नम के साथ संपर्क में त्वचा को साफकागज तौलिया. सुनिश्चित करें कि माउस आगे बढ़ने से पहले साफ और शुष्क है. सही घुटने पर कैंची के साथ एक छोटी सी 2 से 3 मिमी चीरा प्रसारिणी कण्डरा बेनकाब. कृपया माउस धारक जहां माउस शरीर और पैर तैनात किया जाएगा के केंद्र के साथ Vetbond लागू करें. ध्यान से सुरक्षित धारक पर माउस, सही घुटने के नीचे के साथ, सही घुटने की चक्की खात बेनकाब. 2 त्वचा प्रालंब धारकों के बीच में Vetbond इमेजिंग क्षेत्र को स्थिर करने में मदद करने के साथ सही घुटने पट्टा सुरक्षित. मांसपेशियों को और हथियार और धारक के ऊपरी मंच के बाएँ पैर टेप. एक मोड़ टाई का उपयोग करने के लिए जगह में गैस मास्क सुरक्षित. विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे धारक रखें. एलएन बिल्कुल अभी जारी है, माउस की सांस लेने की गति के स्वतंत्र होना चाहिए. इसलिए, सावधानियों जबकि सर्जरी प्रदर्शन पैर की स्थिरता का अनुकूलन करने के लिए लिया जाना चाहिए. पूंछ (आमतौर पर सिर के ऊपर) की स्थिति है कि सबसे बड़ा करने के लिए योगदान देगा निर्धारितसही पैर और नीचे पूंछ टेप करने के लिए स्थिरता. 3. सर्जरी विच्छेदन गुंजाइश के अधीन रहते हुए, माउस शरीर का तापमान बनाए रखने एक अंतरिक्ष हीटर या एक हीटिंग पैड का उपयोग कर. घुटने की चक्की एलएन की सफल इमेजिंग के लिए, यह के सर्जरी भर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उचित शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए लगातार संपर्क में ऊतक के लिए गर्म पीबीएस लागू करने के द्वारा ऊतक नमी बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. Betadine साथ त्वचा जीवाणुरहित. बाँझ कैंची का प्रयोग, मध्य बछड़ा सही में त्वचा के माध्यम से एक midline चीरा बनाने के लिए, और सही जांघ के बेहतर भाग के लिए खड़ी काटने जारी है. ऊर्ध्वाधर चीरा लाइन के दोनों तरफ त्वचा flaps के बनाने के शीर्ष पर दो क्षैतिज त्वचा चीरों बनाओ. वापस लेना और Vetbond साथ दोनों त्वचा flaps के नीचे गोंद. तना हुआ त्वचा खींच Vetbond को लागू करने से पहले आगे पैर स्थिरता को बढ़ावा देने करेंगे, तथापि, सुनिश्चित करें कि त्वचा तनाव रक्त के प्रवाह को रोक देना नहीं करता है (vesse में यानी परिवर्तनमैं रंग या व्यास). त्वचा के अन्य क्षेत्रों के नीचे गोंद करने के लिए जारी रखने के लिए एलएन उजागर करने से पहले पैर की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए. माउस के आकार का निर्धारण करेगा कितना अतिरिक्त त्वचा गोंद की जरूरत है. आमतौर पर, बड़ा चूहों अधिक त्वचा धारक के लिए सरेस से जोड़ा हुआ करने के लिए की आवश्यकता होगी. एलएन जानुपृष्ठीय खात के भीतर या तो सही करने के लिए करना चाहिए झूठ या जानुपृष्ठीय नस छोड़ दिया, धारक पर माउस के स्थान पर निर्भर करता है. आसपास के वसा ऊतकों और मांसपेशियों को सूक्ष्म विदारक चिमटी और संदंश का उपयोग सावधानी से एलएन अलग. खून बह रहा है और आघात को कम करने के लिए, अलग ऊतकों को चिमटी सूक्ष्म विदारक साथ splaying तकनीक का उपयोग करें. ध्यान से अभिवाही और अपवाही रक्त वाहिकाओं और अभिवाही लसीका वाहिकाओं की अखंडता को खतरे में डाले बिना जानुपृष्ठीय एलएन बेनकाब. जोड़ा ऊतक स्थिरता के लिए, एक वर्ग को कवर गिलास से नम एलएन पर तैनात किया जा सकता है, अभी मुश्किल एलएन छू जबकि पोत रोड़ा से परहेज है. कवर कांच निर्धा हो सकता हैमाउस के दोनों तरफ मिट्टी मॉडलिंग के साथ एड. विभिन्न आकारों (जैसे TRITC dextran, के न्यूनतम 70kDa) प्रतिदीप्त पोत रंजक इस बिंदु पर नसों के द्वारा शुरू किया जा सकता है मदद करने के लिए संरचनात्मक संबंध और इमेजिंग के दौरान एल.एन. की अखंडता को उजागर. 4. 2 – फोटॉन इमेजिंग अधिग्रहण ** एक बार एलएन पर्याप्त रूप से संपर्क में है और स्थिरता हासिल है, खुर्दबीन एक पर्यावरण खुर्दबीन 37 में रखा कक्ष में एक प्रोग्राम तापमान प्रतिक्रिया नियंत्रित हीटिंग पैड के साथ सज्जित मंच डिग्री सेल्सियस पर तुरंत पूरे माउस धारक विधानसभा हस्तांतरण जोड़ें पर्याप्त बाँझ गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस या HbSS एलएन डूब. मात्रा आकार और माउस के स्थान पर निर्भर करता है बदल जाएगा. वैकल्पिक रूप से, गर्म पीबीएस या HbSS विच्छेदित एलएन सीधे लागू हो सकता है ठीक एक ग्लास विंदुक एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए फिट के माध्यम से और विसर्जन लेंस उद्देश्य के स्तंभ के लिए टेप. तरल के प्रवाह को ऐसा होना चाहिए कि एकस्थिर पानी स्तंभ लेंस और ऊतक के बीच बनाए रखा जा सकता है. 37 में पीबीएस या HbSS तापमान बनाए रखें डिग्री सेल्सियस एक फीडबैक जांच के साथ एक हीटिंग पैड का उपयोग कर. एक अलग तापमान जांच माउस धारक में रखा जाना चाहिए 36.5 की रेंज में पीबीएस के 37.5 डिग्री सेल्सियस तापमान की पुष्टि एक गुदा जांच भी इमेजिंग सत्र के दौरान मुख्य प्रयोगात्मक माउस के शरीर के तापमान पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक महामारी फ्लोरोसेंट लैंप का प्रयोग करें उद्देश्य के तहत गाइड एलएन नियुक्ति में मदद करने के लिए. मोल फ्लोरोसेंट छवि के ढेर का उपयोग कर समय अंतराल कि वांछित सेलुलर बातचीत (आमतौर पर प्रत्येक xyz छवि ढेर के बीच में 10 सेकंड 1 मिनट) के लिए उपयुक्त हैं. माइक्रोस्कोप अक्सर दृश्य निरीक्षण या एक जानवर की निगरानी प्रणाली का उपयोग करके कक्ष में पशु की स्थिति की निगरानी. अगर माउस पूरी तरह से प्रतिक्रिया की कमी से पैर की अंगुली और / या नाखून pinches संवेदनाहृत है निर्धारित करते हैं, और एक स्थिर, गैर – अस्वाभाविक 60-80 ख के बीच सांस की दरreaths / मिनट. isoflurane के स्तर के अनुसार समायोजित किया जा सकता करने के लिए सुनिश्चित करें कि जानवर पूरी तरह से बेहोश है. उचित निगरानी और hydration के साथ, पशुओं के लिए 4-6 घंटे के लिए imaged किया जा सकता है, या संभवतः अब. इमेजिंग प्रयोग के बाद, सीओ 2 IACUC को मंजूरी दी इच्छामृत्यु प्रोटोकॉल का उपयोग कर कक्ष में पशु euthanize. जानवर के लिए संज्ञाहरण से इच्छामृत्यु करने के लिए पहले से उभरने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए. ** यह शल्य प्रक्रिया intravital 2P – एल एस एम से अन्य इमेजिंग के अन्य रूपों के लिए भी उपयोगी हो सकता है. 5. प्रतिनिधि परिणाम विभिन्न परिसंचारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग दरों पर दत्तक हस्तांतरण के बाद एल.एन. के लिए भर्ती कर रहे हैं. सीडी 4 के लिए + और ​​CD8 + लिम्फोसाइटों, इन कोशिकाओं को उच्च पर्याप्त संख्या 2 से 4 घंटे 6,17-18 बाद जानुपृष्ठीय एलएन में पहुंचने के साथ चार स्थानांतरण के बाद endothelial venule पहले (HEV) के माध्यम से एलएन में पहुंचने शुरू करते हैं. बी सेल के लिएरास, एक पर्याप्त संख्या 24 से 8 से 19 घंटे के बाद जमा करेंगे. सक्रिय DCs से draining जानुपृष्ठीय एलएन लुटेरा 3,11,16-17 इंजेक्शन के बाद 8 से 16 घंटे में दिखाना शुरू कर देना चाहिए. चित्रा 2 से पता चलता है कि अन्य स्थलों के बिना भी, बी सेल रोम के रूप में ऐसी संरचनाओं दौर गोलाकार सेल 2P – एल एस एम 19 के तहत दिखाई संचय के द्वारा आसानी से discerned किया कर सकते हैं. Ubiquitin-GFP splenocytes (चित्रा 2, पूरक वीडियो 1 और 2) के रूप में एक अंतर्जात फ्लोरोसेंट संवाददाता का प्रयोग, एक दिन के लिए इन लिम्फोसाइट प्रवास और व्यवहार पर नज़र रखने के गैर stimulatory शारीरिक शर्तों के तहत एक सप्ताह के लिए कर सकते हैं. मल्टी चैनल उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के साथ, यह एक मल्टीप्लेक्स इमेजिंग डाटासेट है कि कई सेलुलर 17,19 भागीदारों के बीच संरचनात्मक रूप में के रूप में अच्छी तरह से जानकारी बातचीत गतिशीलता शामिल प्राप्त करने के लिए संभव है. जब शल्य चिकित्सा तकनीक ठीक से क्रियान्वित कर रहे हैं और पर्यावरण की स्थिति को ध्यान से नजर रखी lymphocytes विशेषता प्रवास गति, के रूप में चित्रा 2c, 2d और कहीं 13-14,16 में प्रदर्शन एक्ज़िबिट चाहिए. लिम्फोसाइटों भी प्रवास गति में मतभेद एल.एन. के दौर से गुजर इमेजिंग के उप क्षेत्रों के आधार पर प्रदर्शन कर सकते हैं, रक्त वाहिकाओं (के रूप में पोत रंगों का परिचय पर प्रकाश डाला द्वारा) के रूप में अतिरिक्त स्थलों के लिए समग्र इमेजिंग गुणवत्ता (यानी उचित तापमान नियंत्रण निर्धारित करने में मदद करेगा , एल.एन., आदि के लिए न्यूनतम आघात) 3,6,20 आकृति 1. माउस जानुपृष्ठीय एलएन इमेजिंग के लिए माउस धारक के निर्माण) माउस धारक विधानसभा की Schematics, ख) प्रतिनिधि intravital माउस तैयारी, ग) पूर्ण माउस धारक विधानसभा, घ) शल्य चिकित्सा प्रदर्शन के बाद घुटने की चक्की एलएन के विचारों को बंद करो. चित्रा 2. GFP + लिम्फोसाइटों के प्रवास विश्लेषण(क) जानुपृष्ठीय एलएन में 3 डी माउस में एक प्राप्तकर्ता / C57BL 6 2P एल एस एम जानुपृष्ठीय एलएन की इमेजिंग अनुक्रम से लिया स्नैपशॉट adoptively 1×10 GFP 7 + लिम्फोसाइटों 1 इमेजिंग के लिए पहले दिन के साथ स्थानांतरित. पानी का छींटा लाइन बी सेल रोम की सीमा अर्थ, (ख) लिम्फोसाइट प्रवास के निरंतर इमेजिंग के 1 घंटे के दौरान पटरियों, समग्र लिम्फोसाइट प्रवास गति की ग) वितरण. गति मीन = 10.04 ± 4.26 माइक्रोन / मिनट (15,125 विश्लेषण पटरियों की कुल); घ) विभेदकों बी सेल कूप में पाया कोशिकाओं की सेलुलर प्रवास गति के वितरण (खुला सलाखों, मतलब = गति 8.79 ± 3.90 माइक्रोन / मिनट, कुल 1525 पटरियों का विश्लेषण ) और टी सेल क्षेत्र (बंद सलाखों, गति मतलब = 13.77 ± 5.93 माइक्रोन / मिनट, १,२५० विश्लेषण पटरियों की कुल). पैमाने बार = 50 माइक्रोन. पूरक 1 वीडियो एक माउस जानुपृष्ठीय एलएन के रूप में चित्रा 2 में वर्णित समय चूक intravital इमेजिंग 2P – एल एस एम. 1×10 7 लिम्फोसाइटों के कुल अलग थे frओम ubiquitin-GFP + दाता माउस और adoptively में इमेजिंग से पहले 24 घंटे एक C57BL / 6 प्राप्तकर्ता माउस में नसों के द्वारा हस्तांतरित Xy (750 माइक्रोन x 750 माइक्रोन) की एक श्रृंखला प्रतिदीप्ति छवियों निश्चित z ढेर (5 माइक्रोन चरणों 13, कदम) के माध्यम से लिया गया एक xyz इमेजिंग (750 माइक्रोन x 750 माइक्रोन x 65 माइक्रोन) ढेर है, जो हर 20 सेकंड दोहराया गया था उपज 60 मिनट के एक कुल, गति विश्लेषण (आंकड़े -2 सी, 2 डी) के लिए एक xyzt इमेजिंग अनुक्रम में जिसके परिणामस्वरूप के लिए. प्लेबैक 450x = गति. पैमाने बार = 50 माइक्रोन. समय स्टाम्प = मिनट: सेकंड. पूरक वीडियो देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . पूरक वीडियो 2 बी सेल कूप में पूरक 1 वीडियो में इमेजिंग अनुक्रम के दृश्य जू़म में – टी सेल क्षेत्र सीमा. प्लेबैक 450x = गति. पैमाने बार = 25 माइक्रोन. समय स्टाम्प = मिनट: सेकंड सीचाटना करने के लिए पूरक वीडियो देखने के लिए.

Discussion

Vivo में गतिशील सेलुलर व्यवहार के अध्ययन में एक बढ़ती रुचि के द्वारा स्वस्थानी इमेजिंग तकनीक, विशेष रूप से 2P एल एस एम, में उच्च संकल्प में हाल के अग्रिमों के साथ है. एक जीवित माउस के जानुपृष्ठीय एलएन पर 4D इमेजिंग तकनीक undisrupted सूक्ष्म वातावरण ऊतक के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशील व्यवहार में इस तरह के विश्लेषण की अनुमति देता है. कई पूरे दृश्य स्पेक्ट्रम फैले डिटेक्टरों के साथ 2P – एल एस एम का उपयोग एकाधिक सेल आबादी के साथ – साथ इमेजिंग डेटा संग्रह परमिट. यह अब vivo में सेल विशिष्ट फ्लोरोसेंट संवाददाता (जैसे Ubiquitin EGFP, आरएफपी, या eCFP) के विभिन्न लेबल सेल कार्बनिक फ्लोरोसेंट सेल रंगों का उपयोग कर आबादी के दत्तक हस्तांतरण का उपयोग के साथ संयुक्त चूहों में के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है (जैसे CFSE , SNARF-1, और ट्रैकर ऑरेंज सेल) एलएन भीतर सेलुलर तंत्र और समारोह की जांच के. इसके अलावा विभिन्न नज़र रखी ग के बीच बातचीत के प्रत्यक्ष प्रेक्षण के लिएपक्ष आबादी, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग डाटासेट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (जैसे Imaris, BitPlane इंक) के लिए आगे सेल व्यवहार और समारोह को स्पष्ट करने के साथ आगे के विश्लेषण से गुजरना कर सकते हैं. संभावनाओं की एक विस्तृत सरणी के लिए सेलुलर बातचीत vivo में और सिलिको तकनीक में इन का उपयोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए मौजूद है.

प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की मुख्य सीमा यहाँ वर्णित तकनीकी जटिलता सर्जरी दृष्टिकोण में निहित है. इस तकनीक प्रासंगिक शारीरिक रचना और सटीक तकनीकी प्रक्रियाओं और के रूप में इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक कौशल के साथ परिचित बनने के लिए कठोर प्रशिक्षण की आवश्यकता है. आगे उलझी कारकों एलएन अन्वेषण के दौरान ऊतकों को नुकसान को कम करने में कठिनाई, इमेजिंग दौरान ऊतक स्थिरता का अनुकूलन, और पहले एलएन के लिए थर्मल और लेजर चोट को रोकने और इमेजिंग प्रयोग के दौरान शामिल हैं. इन कारकों में से किसी भी गड़बड़ी से कम इष्टतम लसीका में परिणाम होगाocyte गतिशीलता और इसलिए इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करती है जिसके परिणामस्वरूप की उचित व्याख्या के साथ हस्तक्षेप करेगा.

Materials

Reagent	Company	Catalogue Number
Isoflurane, USP	Baxter Healthcare Corporation	NDC 10019-773-60
Vetbond	3M	1469SB
Nair – hair removal lotion	Nair
PBS, 1X	Cellgro	21-040-CV
Heating pad	Watlow
Heating Pad Controller	Watlow
Air and O2	Airgas
Temperature probe	Harvard Apparatus
Tweezers Dumont #5	World Precision Instruments, Inc	14101
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved	World Precision Instruments, Inc	14141
Scissors	Roboz Surgical Instrument Co., Inc	RS-5880
Cover of 100×20 mm glass cell culture dish	Corning	70165-102
Cover of 100×20 mm polystyrene cell culture dish	Corning	430167
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution)	Purdue Products, L.P.	NDC 67618-150-08