Nyligen gjorda framsteg i 2-foton-mikroskopi har möjliggjort realtid<em> I</em> Situ avbildning av levande vävnader i djurmodeller, och därigenom öka vår förmåga att undersöka cellulära beteende i både fysiologiska och patologiska tillstånd. Vi presenterar här de förberedelser som krävs för att utföra intravital avbildning av musen knäveckslymfknutas.
Lymfkörtlar (LNS) är sekundära lymfoida organ, som är strategiskt placerade i hela kroppen för att möjliggöra infångning och presentation av främmande antigener från perifera vävnader att förvärma det adaptiva immunsvaret. Intill mellan medfödda och adaptiva immunsvar är LN en idealisk plats för att studera immunceller interaktioner 1,2. Lymfocyter (T-celler, B-celler och NK-celler), dendritiska celler (DC) och makrofager innefattar huvuddelen av benmärg-härledda cellulära element i LN. Dessa celler är strategiskt placerade i LN att möjliggöra en effektiv övervakning av själv antigener och potentiella utländska antigener 3-5. Den process genom vilken lymfocyter framgång stöter på likartade antigener är ett ämne för intensiv forskning under de senaste åren, och innebär en integrering av molekylära kontakter, inklusive antigenreceptorer, adhesionsmolekyler, kemokiner och stromala strukturer såsom fibro-retikulära nätverket 2,6-12 . </p>
Före utvecklingen av hög upplösning i realtid fluorescerande in vivo imaging, utredare åberopas statiska bilder, som endast erbjuder svar om morfologi, läge och arkitektur. Även om dessa frågor är grundläggande i vår förståelse av immunceller beteende, medger de begränsningar som med denna teknik inte analys att tyda lymfocyter människohandel och miljö ledtrådar som påverkar dynamiska cellens beteende. Nyligen, utveckling av intravital två-foton laser scanning mikroskopi (2P-LSM) har gjort forskare att visa dynamiska rörelser och interaktioner av enskilda celler i levande LNS på plats 12-16. I synnerhet har vi och andra tillämpat denna teknik för att bilden cellulär beteende och samspel inom Poplietallymfknutor LN, där dess kompakta, täta naturen erbjuder fördelen av multiplex datainsamling över en stor vävnad område med olika vävnader sub-strukturer 11,17-18 . Det jagär viktigt att notera att denna teknik ger extra fördelar över explanterade tekniker vävnad imaging, som kräver avbrott av blod, lymfa flöde och slutligen de cellulära dynamiken i systemet. Dessutom explanterade vävnader har en mycket begränsad tidsfönster där vävnaden är lönsamt för avbildning efter uttagandet. Med rätt hydrering och övervakning av djurens miljöförhållanden, kan avbildning tiden avsevärt förlängas med detta intravital teknik. Här presenterar vi en detaljerad metod för framställning av musen poplitea LN för att utföra intravital avbildning.
Senaste framstegen inom högupplöst in situ avbildningstekniker, speciellt 2P-LSM, har åtföljts av en växande intresse för att studera dynamiska cellulära beteende i vivo. 4D bildteknik på Poplietallymfknutor LN av en levande mus tillåter sådana analyser i den dynamiska beteende immunceller inom ostört vävnaden mikro-miljö. Användningen av 2P-LSM med multipla detektorer som spänner över hela det synliga spektrumet medger samtidig avbildning datainsamling av flera cellpopulationer. Detta kan nu uppnås genom användning av in vivo-cell-specifika fluorescerande reportergrupper möss (t.ex. Ubikitin-EGFP,-RFP, eller-eCFP) i kombination med användningen av adoptiv överföring av differentiellt märkta cellpopulationer med organiska fluorescerande färgämnen cell (t.ex. CFSE , Snarf-1 och Cell Tracker Orange) att undersöka cellulära mekanismer och funktion i LN. Förutom den direkt observation av interaktioner mellan differentiellt spåras cEll populationer kan multiplex avbildning datasetet genomgår ytterligare analys med kommersiellt tillgängliga program bildbehandling program (t.ex. Imaris, Bitplane Inc.) för att ytterligare belysa cellens beteende och funktion. Ett brett utbud av möjligheter finns för att studera cellulära interaktionsmekanismer använder dessa in vivo och in silico tekniker.
Den största begränsningen av den experimentella metod som beskrivs här är den tekniska komplexiteten inneboende i operationen strategi. Denna teknik kräver rigorösa utbildning för att bli bekant med relevant anatomi och de exakta tekniska procedurer och färdigheter som krävs i detta protokoll. Ytterligare komplicerande faktorer är svårigheten att minimera vävnadsskada under LN prospektering, optimera vävnaden stabilitet under avbildning och förhindra termisk och laser skador på LN före och under avbildning experiment. Störning på någon av dessa faktorer kommer att resultera i mindre än optimal lymfanocyte motilitet och kommer därför störa korrekt tolkning av den erhållna bilddata analyser.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St Baldrick Stiftelse, Dana Foundation, Gabrielles Angel Foundation och Hyundai Motors of America "Hope-on-Wheels" Program.
Reagent | Company | Catalogue Number |
Isoflurane, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-773-60 |
Vetbond | 3M | 1469SB |
Nair – hair removal lotion | Nair | |
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV |
Heating pad | Watlow | |
Heating Pad Controller | Watlow | |
Air and O2 | Airgas | |
Temperature probe | Harvard Apparatus | |
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc | 14101 |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc | 14141 |
Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5880 |
Cover of 100×20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 |
Cover of 100×20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-150-08 |