En snabb och korrekt point-of-care test för invasiv pulmonell aspergillos presenteras. Det tar fördel av lateralt flöde teknik med användning av en specifik monoklonal antikropp som binder till en<em> Aspergillus</em> Antigen som utsöndras under lunginfektioner. Analysen är kompatibel med serum och brochoalveolar lavage och representerar en ny komplement test för diagnos.
Invasiv pulmonell aspergillos (IPA) är en ledande orsak till morbiditet och mortalitet hos hematologiska maligniteter patienter och hematopoetiska stamceller transplanterade 1. Detektering av IPA är en formidabel diagnostisk utmaning, och i avsaknad av en "gold standard", bygger på en kombination av kliniska data och mikrobiologi och histopatologi där så är möjligt. Diagnos av IPA måste överensstämma med den europeiska organisationen för forskning och behandling av cancer och det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar mykologi Study Group (EORTC / MSG) konsensus definiera "bevisade", "troligt" och "möjlig" invasiva svampsjukdomar 2 . För närvarande har ingen nukleinsyra-baserade tester har externt validerats för IPA upptäckt och så polymeras kedjereaktion (PCR) ingår inte i nuvarande EORTC / MSG diagnostiska kriterier.
Identifiering av Aspergillus i histologiska snitt är problematisk på grund av Simiheter i hyfernas morfologier med andra invasiva svamppatogener 3 och beprövad identifiering kräver isolering av etiologiska agens i ren kultur. Kultur-baserade metoder beroende av tillgången på biopsiprover, men dessa är inte alltid tillgängliga i sjuka patienter och inte alltid ger hållbara spridningsenheter för kultur när det erhållits.
Ett viktigt inslag i patogenesen av Aspergillus är angio-invasion, ett drag som ger möjligheter att spåra svampen immunologiskt med hjälp av tester som upptäcker karakteristiska antigena signaturer molekyler i serum och bronkoalveolär lavage (BAL) vätska. Detta har lett till utvecklingen av Platelia enzymimmunoanalys (GM-EIA) som detekterar Aspergillus galaktomannan och en "pan-svamp"-analys (Fungitell test) som detekterar den konserverade fungös komponenten cellvägg (1 → 3)-β-D- glukan, men inte i Mucorales som saknar denna komponent i deras cellväggar 1,4. Ärstämmer omgivande noggrannheten av dessa tester 1,4-6 har lett till den senaste utvecklingen av nästa generations monoklonala antikropp (MAb)-baserade analyser som detekterar surrogatmarkörer för infektion 1,5.
Thornton 5 beskrev nyligen generering av en Aspergillus-specifik MAb (JF5) med användning av hybridomteknologi och dess användning för att utveckla en immuno-kromatografisk lateralt flöde anordning (LFD) för punkt-of-care (POC) diagnos av IPA. En stor fördel med LFD är dess förmåga att detektera aktivitet eftersom MAb JF5 binder till en extracellulär glykoproteinantigen som utsöndras under aktiv tillväxt av svampen endast 5. Detta är en viktig faktor när man använder vätskor som lung BAL för att diagnostisera IPA eftersom Aspergillus sporer är en vanlig komponent i inandningsluften. Användbarheten av anordningen för att diagnostisera IPA har visats med användning av en djurmodell för infektion, där den LFD visas förbättrad känslighet och specificity jämfört med Platelia GM och Fungitell (1 → 3)-β-D-glukan-analyser 7.
Här presenterar vi en enkel LFD förfarande för att upptäcka Aspergillus-antigen i humana serum och BAL vätskor. Dess snabbhet och noggrannhet ger en ny adjungerad point-of-care test för diagnos av IPA i hematologiska maligniteter patienter.
Slutgiltig identifiering av IPA kan endast verkligen uppnås genom isolering av det etiologiska medlet från biopsiprover, men återhämtning av lämpliga prov är ofta inte möjligt i mycket sjuka patienter och Aspergillus är sällan återvinnas från blodet. Medan stora framsteg har gjorts när det gäller användningen av datortomografi scanning av bröstet i IPA diagnos, egenskaper som tyder på pulmonell IPA såsom "halo" eller "air-Crescent" skyltar är antingen övergående eller kan hänföras till andning artefakter eller andra svampinfektioner 11,12. Sådana uppgifter är därför kompletteras med serologiska tekniker som syftar till att identifiera signatur molekyler (GM β-glukan) från svampar som cirkulerar i patientens serum eller som finns i BAL vätska, sputum eller urinprover 13. Även om dessa tester visar tillfredsställande känslighet, saknar de tillräcklig specificitet eller lider av störningar under vissa förutsättningar 1,6 </sup>.
Den LFD test för IPA upptäckt presenteras här gör det möjligt för "point-of-care" diagnos av IPA och bedrifter teknik som har använts hittills i test för påvisande av virus, bakterier, parasiter och toxiner 14-19 och mest känt, för hem graviditetstest som först infördes genom Unipath 1988. I Aspergillus LFD som beskrivs här, är Aspergillus-specifik MAb JF5 immobiliseras till en infångningszon (testet linje) på ett poröst nitrocellulosamembran. Anti-mus-immunglobulin immobiliserad på membranet i en separat zon tjänade som en intern kontroll (kontroll linje). Vid tillsats av serum eller BAL-vätskan till tömningsporten binder MAb JF5-kolloidalt guldkonjugat i frisättning dynan till målantigenet och komplexet passerar sedan längs det porösa membranet genom kapillärverkan. MAb JF5 immobiliserad i infångningszonen binder till JF5-kolloidalt guld och antigen komplex resulterade i en röd testlinjen. Eventuell obunden JF5-kolloidalt guldkonjugat binder till den interna kontrollen indikerar att analysen har att fungera korrekt. Detta resulterar i en röd styrledning.
Testet är snabb, tar endast 15 minuter att utföra, är billig i jämförelse med serum och BAL tester baserade på GM och β-glukan upptäckt och inte kräver dyr utrustning eller omfattande faciliteter laboratorium för att köra. Dessutom, inte MAb JF5 korsreagerar inte med droger eller föroreningar som har visat sig orsaka falskt positiv reaktion i GM och β-glukan tester 1,4,6. En ytterligare stor fördel jämfört med nuvarande diagnostiska tester är LFDs förmågan att detektera aktivitet som är indikativ för invasiv tillväxt av Aspergillus-arter.
Ett kritiskt steg i LFD förfarandet är behovet av att läsa resultaten 15 minuter efter applicering av serum eller BAL prov till enheten. Testet bör inte lämnas för längre tid än 15 min innan du spelar in resultaten, eftersom detta kan fördomar resultat interpretatividare. En svag reaktion kommer inte att förbättras genom att förlänga inkubationsperioden. Värmebehandling av serum från djurmodeller av infektion har visat sig förbättra analyskänsligheten. En begränsning av testet är att det är kvalitativ och bygger på operatören att göra en subjektiv bedömning av positivitet. Intensiteten hos den testlinjen varierar beroende på de antigen-innehållet i serum och BAL-prover (fig. 1). Emellertid indikerar någon positiv reaktion (bestämdes genom jämförelse med kända negativa) närvaron av Aspergillus-antigen och således infektion. För att begränsa subjektivitet LFD analyser, handhållna enheter är tillgängliga som tillåter kvantifiering av LFD intensiteter testlinje och möjliggöra etablering av tröskelvärden för att påvisa antigen 20.
Framtida utveckling av LFD inkluderar dess kommersialisering och utveckling av en multiplex LFD som tillåter samtidig detektering av andra invasiva svamppatogenermed mycket specifika MAbs 3.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering Dr Thornton från Pfizer Limited tacksamt erkänns.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Aspergillus LFD | University of Exeter | Available from the corresponding author on request | |
RPMI-1640 | Sigma | R0883 | |
L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
Fetal calf serum | Biosera | S9100 | Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM |
EDTA | Fisher Scientific | BPE120-1 |