Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico
Summary
La producción endógena de óxido nítrico (NO) regula una amplia variedad de funciones biológicas. Cada vez es más claro que la interrupción o la desregulación de la señalización de NO basado en está involucrado en muchas enfermedades humanas. Los métodos para cuantificar los metabolitos relevantes no pueden proporcionar nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de la enfermedad humana.
Abstract
El óxido nítrico (NO) es un radical libre diatómico que es muy corta duración en los sistemas biológicos (menos de 1 segundo en la sangre circulante) 1. NO puede ser considerada como una de las moléculas de señalización más importantes se producen en nuestro cuerpo, regulación de las funciones esenciales, incluyendo pero no limitado a la regulación de la presión arterial, la respuesta inmune y de la comunicación neuronal. Por lo tanto su detección y cuantificación precisa en matrices biológicas es fundamental para comprender el papel del NO en la salud y la enfermedad. Con una vida media corta fisiológica de NO, estrategias alternativas para la detección de productos de reacción de NO bioquímica se han desarrollado. La cuantificación de los metabolitos de NO relevantes en múltiples compartimentos biológicos proporciona una valiosa información con respecto a la producción de NO in vivo, la biodisponibilidad y el metabolismo. Basta con un solo compartimiento de muestreo, tales como sangre o plasma no siempre puede proporcionar una evaluación precisa de toda body No hay ningún estado, particularmente en los tejidos. La capacidad de comparar la sangre con los tejidos seleccionados en animales de experimentación ayudará a cerrar la brecha entre la ciencia básica y la medicina clínica en cuanto a la utilidad diagnóstica y pronóstica de NO biomarcadores en la salud y la enfermedad. Por lo tanto, la extrapolación de NO estado de plasma o sangre a los tejidos específicos de interés ya no es un enfoque válido. Como resultado, los métodos siguen siendo desarrollado y validado, que permiten la detección y cuantificación de los productos NO y NO relacionadas o metabolitos en los compartimentos múltiples de animales de experimentación in vivo. El paradigma establecido de la bioquímica de la producción de NO por el NO sintasa a la activación de la guanilato ciclasa soluble (GCs) a la oxidación final a nitrito (NO 2 -) y nitrato (NO 3 -) sólo puede representar parte de ninguna de los efectos in vivo. La interacción de los metabolitos de NO y NO-derivado con tioles de proteínas, aminas secundarias, y los metales para formar S-nitrosothioles (RSNOs), N-nitrosaminas (RNNOs), y nitrosilo hemo-representan respectivamente cGMP independientes efectos de NO y son probablemente tan importante como fisiológicamente activación de GCs por NO. Una verdadera comprensión de NO en la fisiología se deriva de los experimentos in vivo de muestreo compartimentos múltiples simultáneamente. El óxido nítrico (NO), la metodología es una ciencia compleja ya menudo confusa y el foco de muchos debates y discusión sobre la bioquímica NO. La elucidación de nuevos mecanismos y vías de señalización que involucran NO depende de nuestra capacidad de concreto, de forma selectiva y sensible detección y cuantificación de NO y NO todos los productos relevantes y sus metabolitos en matrices biológicas complejas. A continuación, presentamos un método para el análisis rápido y sensible de nitritos y nitratos por HPLC, así como la detección de NO libre en muestras biológicas de quimioluminiscencia basado en la capa de ozono in vitro con derivitazation química para determinar el origen molecular de NO, así como ex vivo conórgano miografía baño.
Protocol
Discussion
Los métodos descritos aquí para la cuantificación de los metabolitos de NO relevantes en múltiples compartimentos biológicos permitirá a las huellas dactilares del NO de la biología en la salud y la enfermedad que se puede correlacionar con las medidas funcionales de NO por el endotelio. Estos métodos requieren la preparación de muestras sencilla con un potencial de adaptación para un alto rendimiento. La cantidad relativa de estas moléculas pueden ayudar a comprender la producción de NO y su destino metabó…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Hong Jiang, Ph.D. y Deepa Parathasarthy, MPH, BDS para la asistencia técnica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| N-ethylmaleimide | Thermo Scientific | 23030 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 |
| Autosampler | Alcott | |
| DMT Myograph | AD Instruments | |
| PowerLab | AD Instruments | |
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
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