La dissection de souris adultes et utricule adénovirus-support cellulaire des infections
Summary
Cellules ciliées mécanosensorielle sont les cellules réceptrices de l'oreille interne. Le mieux caractérisé<em> In vitro</emSystème modèle> de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d'organes de utricules de souris adultes. Nous présentons la dissection de l'utricule souris adulte, et nous démontrons adénovirus infection de cellules de soutien dans les utricules culture.
Abstract
La perte d'audition et de troubles de l'équilibre sont souvent causés par la mort des cellules ciliées mécano, qui sont les cellules réceptrices de l'oreille interne. Comme il n'y a pas de ligne de la cellule qui représente de façon satisfaisante les cellules ciliées de mammifères, de la recherche sur les cellules ciliées se fonde sur les cultures d'organes primaires. Le mieux caractérisé dans le système modèle in vitro de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d'organes de utricules de souris adultes (Figure 1) 1-6. L'utricule est un organe vestibulaire, et les cellules ciliées de l'utricule sont semblables dans les deux à la structure et la fonction des cellules ciliées de l'organe auditif, l'organe de Corti. La préparation utricule souris adultes représente un épithélium sensoriel maturité pour les études des signaux moléculaires qui régulent la survie, l'homéostasie, et la mort de ces cellules.
Mammifères cellules ciliées cochléaires sont définitivement différenciés et ne sont pas régénérés quand ils sont perdus. En non-mamvertébrés maliens, auditif ou vestibulaire de la mort des cellules ciliées est suivie d'une régénération robuste qui rétablit les fonctions auditives et l'équilibre 7, 8. La régénération des cellules de cheveux est médiée par la glie-comme les cellules de soutien, qui sont en contact les surfaces basolatérale des cellules ciliées de l'épithélium sensoriel 9, 10. Cellules de soutien sont aussi des médiateurs importants de la survie des cellules ciliées et de la mort 11. Nous avons récemment développé une technique pour l'infection des cellules de soutien dans les utricules cultivées en utilisant des adénovirus. Utilisation adénovirus de type 5 (dE1/E3) pour fournir un transgène contenant la GFP sous le contrôle du promoteur CMV, nous constatons que l'adénovirus spécifiquement et efficacement infecte les cellules de soutien. Soutenir l'efficacité infection de la cellule est d'environ 25-50%, et les cellules ciliées ne sont pas infectés (Figure 2). Surtout, nous constatons que l'infection adénovirale de cellules de soutien n'entraîne pas de toxicité pour les cellules ciliées ou des cellules de soutien, comme nombre de cellules dans Ad-GFP infutricules ecté sont équivalentes à celles en situation de non-infectés utricules (Figure 3). Ainsi l'expression des gènes adénovirus dans des cellules de soutien de utricules culture fournit un outil puissant pour étudier les rôles des cellules de soutien en tant que médiateurs de la survie des cellules des cheveux, la mort et la régénération.
Protocol
Discussion
Cellules ciliées sensorielles sont sensibles à la mort causée par une variété de stress, notamment le vieillissement, traumatisme sonore, et l'exposition à des médicaments ototoxiques, y compris les antibiotiques aminoglycosides et le cisplatine agent antinéoplasique. Dans les résultats mammifères cheveux de la mort cellulaire dans la perte d'audition permanente et / ou perturbation de l'équilibre. Dans les systèmes de modèle in vitro sont des outils essentiels pour les études…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Division de la recherche intra-muros à l'Institut national sur la surdité et les troubles de communication. Un soutien supplémentaire a été fourni par NIDCD 5R01 DC007613.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
| DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
| Penicillin G | Sigma | P3032 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
| Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
| sodium borohydride | Sigma | 452882 |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
| Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.
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