Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs
Summary
Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.
Abstract
La moelle osseuse est le site principal où les CSH et progéniteurs plus matures du sang lignée de cellules résident et de se différencier dans un organisme adulte. CSH constituent une population de cellules minute de cellules pluripotentes, capables de générer toutes les lignées de cellules sanguines pour une durée de vie 1. La dissection moléculaire de l'homéostasie CSH dans la moelle osseuse a des implications importantes dans l'hématopoïèse, l'oncologie et la médecine régénérative. On décrit le protocole de marquage avec des anticorps fluorescents et la procédure de déclenchement électronique de cytométrie de flux à marquer sous-ensembles progénitrices hématopoïétiques et de distribution CSH chez la souris individuels (fig. 1). En outre, nous décrivons une méthode pour enrichir largement progéniteurs hématopoïétiques ainsi que à long terme (LT) et à court terme (ST) de reconstituer les CSH à partir de suspensions de cellules de moelle osseuse regroupées par enrichissement magnétique des cellules exprimant c-Kit. Préparation cellulaire obtenu peut être utilisé pour trier des sous-ensembles sélectionnés pour in vitro etin vivo des études fonctionnelles (Fig. 2).
Les deux ostéoblastes trabéculaires 2,3 et 4 endothélium sinusoïdal constituent des niches fonctionnelles de soutien CSH dans la moelle osseuse. Plusieurs mécanismes de la niche ostéoblastique, y compris un sous-ensemble de N-cadhérine + de 3 ostéoblastes et l'interaction de l'Tie2 récepteur tyrosine kinase exprimée en CSH avec son angiopoïétine-1 ligand 5 accord pour déterminer la quiescence CSH. "Hibernation" dans la moelle osseuse est cruciale pour protéger les CSH de la réplication et l'épuisement éventuel sur l'activité vélo excessive 6. Stimuli exogènes agissant sur les cellules du système immunitaire inné comme ligands du récepteur Toll-like 7 et l'interféron-alpha 6 peut également induire la prolifération et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques dans la lignée progéniteurs engagés. Récemment, une population de cellules souches hématopoïétiques de souris dormants dans le lin – c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 – CD34 – la population a été décrite 8. Le tri des cellules CD34 sur la base de l'expression de la suspension cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques enrichi tel que décrit ici permet l'isolement de deux repos d'auto-renouvellement LT-HSC et ST-HSC 9. Une procédure similaire basée sur l'épuisement des lignées de cellules positives et de tri de LT-HSC avec CD48 et FLK2 anticorps a été décrit précédemment 10. Dans le présent rapport, nous fournir un protocole pour la caractérisation phénotypique et ex vivo du cycle cellulaire analyse des progéniteurs hématopoïétiques, qui peuvent être utiles pour surveiller l'hématopoïèse dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. En outre, nous décrivons un tri par FACS procédure de CSH, qui peuvent être utilisés pour définir les facteurs et les mécanismes régissant leur auto-renouvellement, l'expansion et la différenciation en biologie cellulaire et des dosages de transduction du signal, ainsi que pour la transplantation.
Protocol
Discussion
La méthode décrite ici permet une analyse rapide et précise de l'hématopoïèse chez la souris individuels (Figure 1). Cette analyse dans divers contextes expérimentaux, y compris des modèles murins de l'inflammation, l'auto-immunité, l'immunodéficience, les maladies dégénératives, les troubles métaboliques et du cancer, permet l'adressage de l'impact des conditions pathologiques sur l'hématopoïèse. La figure 3 montre l'analyse de l'act…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa et Markus Manz pour obtenir des conseils précieux. Ce travail a été financé par la National Science Foundation suisse, la Ligue suisse contre le cancer et la Fondazione per la Ricerca tessinois sul Cancro.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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