ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות
Summary
שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.
Abstract
מח העצם הוא האתר העיקרי שבו HSCs ובוגרת יותר כדוריות הדם אבות השושלת מתגוררים ולהבחין באורגניזם הבוגר. HSCs מהווים אוכלוסייה תא גזע pluripotent דקה של תאים המסוגלים לייצר את כל שושלות תאים דם בפעם חיים 1. דיסקציה המולקולרי של הומאוסטזיס HSCs במח העצם יש השלכות חשובות hematopoiesis, אונקולוגיה ורפואה רגנרטיבית. אנו מתארים את פרוטוקול סימון נוגדנים הניאון הליך gating אלקטרוני cytometry זרימת להבקיע תת אבות היווצרות הדם והפצה HSCs בעכברים בודדים (איור 1). בנוסף, אנו מתארים שיטה בהרחבה להעשיר אבות hematopoietic כמו גם לטווח ארוך (LT) ו לטווח קצר (ST) לשחזר HSCs מ אספו מח עצם השעיות התא על ידי העשרת המגנטי של תאים המבטאים C-Kit. הכנת התא וכתוצאה מכך ניתן להשתמש כדי למיין תת שנבחרו במבחנהבמחקרים תפקודית ב vivo (איור 2).
שני osteoblasts trabecular 2,3 ו -4 האנדותל סינוסי מהוות נישות תפקודית התומכים HSCs במח העצם. מספר מנגנונים בנישה osteoblastic, כולל משנה של N-cadherin + osteoblasts 3 ואינטראקציה של הקולטן טירוזין קינאז Tie2 לידי ביטוי HSCs עם angiopoietin-1 ליגנד שלה 5 מסכים בקביעת קפאון HSCs. "מצב שינה" במח העצם הוא חיוני כדי להגן על HSCs מ שכפול תשישות בסופו של דבר על פעילות רכיבה על אופניים יתר 6. גירויים חיצוניים הפועלים על תאים של מערכת החיסון המולדת כגון חיוג כמו ligands הקולטן 7 ו אינטרפרון אלפא-6 יכול גם לגרום ריבוי והתמיינות של HSCs לתוך אבות מסורים השושלת. לאחרונה, אוכלוסיית HSCs עכבר רדומים בתוך לין – C-Kit + SCA-1 + CD150 + CD48 – CD34 – האוכלוסייה תוארה 8. מיון של התאים על ביטוי CD34 מן ההשעיה אבות מועשר hematopoietic התא כמתואר כאן מאפשר בידוד של שניהם שוקט עצמית חידוש LT-HSCs ו ST-HSCs 9. הליך דומה על דלדול של תאים החיוביים השושלת ומיון של LT-HSC עם CD48 ו Flk2 נוגדנים תוארה קודם לכן 10. בדו"ח הנוכחי אנו מספקים פרוטוקול אפיון פנוטיפי ו vivo לשעבר לתא מחזור ניתוח של אבות היווצרות הדם, אשר יכול להיות שימושי עבור ניטור hematopoiesis בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. יתר על כן, אנו מתארים FACS מיון הליך HSCs, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להגדיר את גורמי ומנגנוני ויסות עצמי חידוש שלהם, הרחבת והבחנה בביולוגיה של התא התמרה מבחני אות כמו גם להשתלה.
Protocol
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח מהיר ומדויק של hematopoiesis בעכברים בודדים (איור 1). זה ניתוח במסגרות ניסיוניות שונות, כולל מודלים Murine של דלקת, אוטואימוניות, כשל חיסוני, מחלות ניווניות, הפרעות מטבוליות וסרטן, מאפשרת מענה את ההשפעה של התנאים פתולוגיים על hematopoiesis. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Nobuyuki Onai, היטושי Takizawa ומרקוס Manz לייעוץ יקר. עבודה זו מומנה על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע, השוויצרי סרטן הליגה Fondazione Ticinese לכל la RIcerca sul Cancro.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, . Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
