Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores
Summary
Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.
Abstract
A medula óssea é o principal local onde HSCs e glóbulos mais maduros progenitores da linhagem residem e se diferenciar em um organismo adulto. HSCs constituem uma população de células minutos de células pluripotentes, capazes de gerar todas as linhagens de células do sangue para um tempo de vida-1. A dissecção molecular da homeostase HSCs na medula óssea tem implicações importantes na hematopoiese, oncologia e medicina regenerativa. Nós descrevemos o protocolo marcação com anticorpos fluorescentes e ao processo gating electrónico na citometria de fluxo para marcar subconjuntos progenitoras hematopoiéticas e distribuição HSCs em ratinhos individuais (Fig. 1). Além disso, nós descrevemos um método para enriquecer extensivamente progenitores hematopoiéticos, bem como a longo prazo (LT) e de curto prazo (ST) reconstituindo HSCs a partir do conjunto de osso suspensões de células de medula através de um enriquecimento magnética de células que expressam c-Kit. A preparação de células resultante pode ser usada para classificar os subconjuntos seleccionados para in vitro eOs estudos in vivo funcionais (Fig. 2).
Ambos os osteoblastos trabeculares 2,3 e 4 endotélio sinusoidal constituem nichos funcionais de apoio HSCs na medula óssea. Vários mecanismos no nicho osteoblástico, incluindo um subconjunto de osteoblastos + N-caderina 3 e interação do receptor tirosina quinase TIE2 expressa em HSCs com sua angiopoietina-1 ligando cinco concorrem na determinação quiescência HSCs. "Hibernação" da medula óssea é fundamental para proteger HSCs de replicação e eventual exaustão sobre a atividade de ciclismo excessiva 6. Estímulos exógenos que actuam sobre as células do sistema imune inato, tais como ligandos de receptores Toll-like 7 e interferão-a 6 também pode induzir a proliferação e diferenciação de HSCs em linhagem progenitores comprometidos. Recentemente, uma população de HSCs rato latentes dentro do lin – c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 – CD34 – A população tem sido descrito 8. Triagem de células com base em CD34 expressão a partir da suspensão de células hematopoiéticas progenitoras enriquecido como descrito aqui permite o isolamento de ambos quiescente auto-renovação LT-HSCs e ST-HSCs 9. Um procedimento semelhante com base na depleção da linhagem de células positivas e triagem de LT-HSC com CD48 e Flk2 anticorpos foi previamente descrita 10. No presente relatório, nós fornecemos um protocolo para a caracterização fenotípica e ex vivo análise do ciclo celular de células progenitoras hematopoéticas, que pode ser útil para monitorar a hematopoiese em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Além disso, descrevem um procedimento para a triagem FACS HSCs, que podem ser utilizados para definir os factores e mecanismos que regulam a sua auto-renovação, expansão e diferenciação em biologia celular e os ensaios de transdução de sinal, bem como para o transplante.
Protocol
Discussion
O método aqui descrito permite a análise rápida e precisa da hematopoiese em ratinhos individuais (Figura 1). Esta análise em várias configurações experimentais, incluindo modelos murinos de inflamação, auto-imunidade, imunodeficiências, doenças degenerativas, doenças metabólicas e câncer, permite abordar o impacto de condições patológicas na hematopoiese. Figura 3 mostra a análise da atividade de ciclo celular em LKS eletronicamente fechados CD34 -</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa e Markus Manz para o conselho precioso. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation suíço, suíço Cancer League e Ticinese Fondazione per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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